En las últimas décadas ha habido una transformación de una agricultura productivista, que asegurase el abastecimiento de los productos agrícolas por una agricultura denominada sostenible preocupada por el medioambiente. Este cambio ha provocado que los productos fitosanitarios deban cumplir unos requisitos para que su uso sea más respetuoso con el medioambiente. Los ensayos biológicos son una metodología rápida y sencilla para detectar el parámetro más sensible y establecer el rango de dosis que produce efecto fitotóxico en un cultivo. En este trabajo se ha estudiado este efecto con dos herbicidas de la familia ciclohexanodionas en un cultivo de trigo.
INTRODUCCIÓN
En la directiva 91/414/CEE relativa a la comercialización de productos fitosanitarios dentro de la Unión Europea (ANON, 1991), se exige que los productos fitosanitarios que se comercialicen y usen en la Unión Europea no produzcan efectos nocivos para la salud humana o animal, ni repercusiones inaceptables para el medio ambiente y que los residuos resultantes de su aplicación no tengan efectos nocivos para la salud humana o animal, ni para las aguas subterráneas, ni repercusiones inaceptables para el medio ambiente, y que se puedan medir con métodos generalmente aceptados. Como consecuencia de ello, en los últimos veinte años, la atención en el desarrollo de los herbicidas se ha desplazado desde compuestos no-polares, persistentes y de larga vida, a sustancias químicas más polares, degradables, térmicamente lábiles y cuyas dosis de aplicación sea la menor posible, afín de evitar la acumulación de residuos en el medio. Sin embargo, los herbicidas que poseen una naturaleza polar, como las ciclohexanodionas, tienen una gran movilidad medioambiental que aumenta su posibilidad de lixiviación. Esta combinación de factores (baja dosis de aplicación y gran movilidad) hace su análisis difícil a los niveles de trazas (ppb) que son necesarios para conocer su destino medioambiental.
El desarrollo de estos nuevos herbicidas ayuda a solucionar el problema de acumulación y contaminación de suelos y acuíferos, a la par que reduce la exposición de seres humanos y fauna silvestre a los mismos. Sin embargo, este tipo de materias activas que son efectivos a estas dosis, tiene por contrapartida que el residuo que permanece en el suelo, aunque reducido, es también muy efectivo, y puede resultar fitotóxico para otros cultivos sucesivos que sean especialmente sensibles a dicho productos. En los últimos años, se ha puesto de manifiesto la carencia de datos relativos a los efectos fitotóxicos de los residuos de herbicidas sobre otros cultivos. En consecuencia, es necesario conocer el efecto fitotóxico potencial en los cultivos. Los bioensayos o ensayos biológicos aplicados a la investigación de herbicidas se basan en la respuesta de organismos elegidos como testigos a la aplicación del herbicida que se quiere ensayar (HOROWITH, 1976).
Estos bioensayos son una herramienta necesaria que proporciona una información muy valiosa acerca de la fitotoxicidad de la sustancia activa y sobre la cantidad de sustancia que realmente va a tener efecto tóxico sobre la planta. Sin embargo, los bioensayos no deben utilizarse como único método para detectar niveles de residuos ya que los resultados pueden ser difíciles de interpretar debido a la falta de conocimiento sobre el comportamiento del herbicida en el medio. La concentración del herbicida se ve sometida a variaciones como consecuencia de procesos de degradación en función de las características físico-químicas del compuesto y las propiedades del medio y van a dar lugar a la formación de metabolitos y productos de degradación que pueden poseer una fitotoxicidad y/o una actividad que es desconocida.
Por lo tanto, los métodos químicos nos permiten cuantificar e identificar la sustancia activa y los metabolitos y los bioensayos, como herramienta complementaria, nos permite detectar la fitotoxicidad de estos productos. La Comisión Europea (ANON, 2000) ha aceptado y recomendado la utilización de los bioensayos como método aceptable para excluir la presencia de compuestos fitotóxicos a niveles menores de 50g m.a./ha. Sin embargo, estos niveles tan reducidos, pueden producir efectos fitotóxicos: se ha demostrado que concentraciones en el suelo menores de 5 ppb de sulfonilureas pueden reducir el crecimiento en cultivos sensibles (HERNÁNDEZ-SEVILLANO y col., 2001). Los ensayos hidropónicos en solución nutritiva resultan sencillos y rápidos, ya que, al disolverse el herbicida en una solución nutritiva, éste queda muy disponible para la planta, y los efectos fitotóxicos aparecen rápidamente. Este tipo de ensayos, que suelen se de corta duración, permiten conocer rápidamente las especies y los parámetros biologicos más sensibles al herbicida utilizado, y el rango de dosis mínimas del mismos que resultan tóxicas para la planta indicadora escogida. En el caso de las ciclohexanodionas se han realizado bioensayos para detectar fitotoxicidad con el herbicida setoxidim (HSIAO y SMITH, 1983) y en nuestro grupo se observó que la falta de repetibilidad que tenia lugar cuando se realizaban bioensayos hidropónicos con tepraloxidim era debido a la presencia de cloro en el agua empleada para la preparación de la solución nutritiva (SANDÍN-ESPAÑA y col., 2003).
En este estudio se han ajustado las dosis que tienen efecto sobre el trigo. Las ciclohexanodionas (CHD) comúnmente conocidas como DIM´s, son herbicidas introducidos a principios de la década de los ochenta del pasado siglo, como herbicidas selectivos de post-emergencia para el control de malas hierbas gramíneas en cultivos de cereales y dicotiledóneas.
Estos herbicidas, son generalmente activos a bajas concentraciones y presentan una baja toxicidad, lo cual hace que puedan ser ampliamente utilizados. Su vía de absorción es foliar y se translocan a los meristemos donde inhiben la acetil-CoA.carboxilasa (ACCasa), enzima que cataliza el primer paso común para la síntesis de ácidos grasos (INCLEDON y col., 1997). Esta inhibición evita la producción de fosfolípidos que es necesaria para la formación de nuevas membranas par ael crecimiento celular. La dosis de aplicación del tepraloxidim es de 50-100 g.m.a/ha y la del tralkoxidim de 150-400 g.m.a/ha.
En cuanto a su estructura química, además del anillo ciclohexano-1,3-diona, es esencial para la actividad fitotóxica el grupo etoxiimino unido en la posición 2 del anillo (LICHTENTHALER, 1990). En la Figura 1 se muestran las estructuras químicas de los compuestos pertenecientes a esta familia que se han estudiado.
Material y métodos
Material
El producto comercial del herbicida tepraloxidim, BAS 620 00 H, (Figura 1) y el patrón analítico (2- [(E)-1-[(E)-(3-cloroaliloxiimino]propil]-3-hidroxi- 5-(4-tetrahidropiranil)-2-ciclohexenona,) (99,9 %) fue suministrado por BASF Ltd (Limburgerhof, Alemania). El producto comercial del herbicida tralkoxidim, Splendor-25 SC fue suministrado por Zeneca (Gran Bretaña) y el patrón analítico (2-[(E)-1- (etoxiimino)propil]-3-hidroxi-5-(2,4,6-trimetilfenil)- 2-ciclohexenona, (99%)) (Figura 1) fue adquirido de Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Alemania).
La solución nutritiva empleada en los bioensayos se preparó a partir de una solución de macronutrientes y oligoelementos según Hewitt y Bould (1963). El agua empleada para la realización de la solución nutritiva fue agua embotellada libre de cloro. Para el análisis cromatográfico se empleó acetonitrilo y agua de grado HPLC suministrados por Lab-scan (Stillorgan, Co. Dublín, Irlanda).
El ácido fórmico (grado analítico, 98%) fue proporcionado por la casa comercial Panreac (Barcelona, España). Para medir la concentración de 1 ppm empleada en los bioensayos se llevó a cabo mediante un cromatógrafo de líquidos con dos bombas (System Gold 126 Solvent Module) con detector ultravio leta de onda variable (200-290 nm) Beckman 166 e inyector automático (System Gold 508) con inyección de 50 ?L. Los datos cromatográficos fueron recogidos y analizados mediante el software Beckman System Gold. Los compuestos se separaron mediante una columna Nova-Pack C18 (150 x 3.9 mm, 4 ?m de partícula) suministrado por Waters (Milford, MA, USA). El material vegetal empleado en los bioensayos fueron semillas de trigo Triticum aestivum L. cv. Marius; suministradas por Agrar Semillas S.A. (Zaragoza, España).
Los bioensayos se realizaron en cámara de crecimiento de plantas bajo condiciones controladas con un fotoperiodo de 16 horas de luz, con una iluminación de 110-115 ?Em-2s-1 a una temperatura de 22 ± 1ºC y 8 horas de oscuridad a 16 ± 1ºC, con una humedad relativa del 70%.
Procedimiento Experimental
Se preparó una disolución patrón de los herbicidas tepraloxidim y tralkoxidim de 1 mg/l en solución nutritiva. Esta disolución fue empleada para preparar soluciones más diluidas de las dosis empleadas en los bioensayos. Para la preparación de estas disoluciones también se empleó solución nutritiva.
Esta concentración fue medida mediante cromatografía líquida. Las semillas de trigo se pregerminaron en placas de Petri de 9 cm, sobre dos discos de papel de filtro humedecido en agua destilada, durante 48 horas y en cámara de crecimiento.
Posteriormente, cuando la raíz fue visible y el coleoptilo alcanzó entre 2 y 3 mm, se midió la raíz y las semillas se colocaron sobre rejillas plásticas acopladas a vasos desechables (220 ml). Los vasos, cubiertos con una cartulina negra para proteger la solución nutritiva y las raíces de la luz, se rellenaron de solución nutritiva con la dosis correspondiente de herbicida (aproximadamente 160 ml) asegurando el contacto del sistema radicular con las soluciones.
Cada experimento consistió en 5 repeticiones por concentración con 5 plántulas por vaso. Los vasos fueron distribuidos al azar en bandejas y colocados en la cámara de crecimiento. Se añadió solución nutritiva a las plantas cada dos días en la base de cada planta, asegurando el contacto de la solución con la raíz. Las plantas se mantuvieron en la cámara de crecimiento durante siete días, después de los cuales se midieron las siguientes variables: crecimiento de raíz y peso fresco de la parte aérea, peso seco aéreo peso seco de raíz. Mediante la realización de bioensayos preliminares se ajustó el rango óptimo para la realización de una curva dosis-respuesta. Una vez ajustado el rango el bioensayo se repitió por duplicado.
Las dosis empleadas en los bioensayos para la obtención de la curva dosis-respuesta con ambos herbicidas fueron entre 0 y 32 ppb. Las concentraciones de las soluciones de los dos herbicidas en solución nutritiva se analizaron para asegurar que su concentración no se viera afectada por la solución nutritiva, mediante calibración externa por comparación del área de los picos con aquellas obtenidas de las soluciones estándar.
Se prepararon disoluciones patrón de 50 mg/l. El patrón de tepraloxidim se pesó y se disolvió en la mínima cantidad de acetonitrilo en un matraz aforado, enrasándose hasta el volumen deseado con agua. Las disoluciones estándar se almacenaron en la oscuridad a 4ºC. Los patrones de tralkoxidim se prepararon disolviéndolos en metanol debido a su baja solubilidad en agua y acetonitrilo. La preparación de soluciones más diluidas se realizó a partir de la solución de 50 mg/l añadiendo agua hasta el volumen deseado. Las disoluciones de tralkoxidim son estables al menos durante una semana a 4ºC en la oscuridad.
Para el análisis cromatográfico se tomaron 50 ?L de muestra después de detener la reacción y se inyectaron por duplicado en el sistema cromatográfico. El flujo fue en todos los casos de 1 ml/min. La fase móvil fue acetonitrilo/agua con un 0,1% de ácido fórmico. Se calcularon las correspondientes rectas de calibración entre 0,25 y 4 ppm
Análisis estadístico
Los valores de las variables se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) y las medias se compararon mediante el test de rango múltiple de Newman- Keuls a un nivel de significación del 5%. Las variables medidas fueron; longitud y crecimiento de raíz, peso seco de parte aérea y raíz. El parámetro mas sensible se empleó en el cálculo de las curvas dosis respuesta para cada herbicida mediante regresión no lineal ajustando al modelo logístico (SEEFELDT y col., 1995; HERNÁNDEZSEVILLANO y col., 2001), obteniéndose el valor EC50 (dosis a la cual se produce un 50% de reducción del parámetro).
Resultados y discusión
Las condiciones cromatográficas empleadas para el estudio cinético de degradación de cada herbicida así como el tiempo de retención obtenido se muestra en la Tabla 1. Para conocer la concentración de los herbicidas en cada momento del estudio cinético se calcularon las rectas de calibración entre 1 y 10 ppm (n = 5), (Tabla 1). En todos los casos la concentración de los herbicidas fue de 1 ppm.
Los resultados de estos ensayos mostraron que la raíz se vio más afectada por la acción de los herbicidas que la parte aérea (Tabla 2 y 3). En la Tabla 2 y 3 se muestra el rango de dosis efectivas y las reducciones que éstas producen en el crecimiento de la raíz y parte aérea de las plantas. Entre los parámetros medidos el más sensible fue el crecimiento de raíz de acuerdo también con estudios anteriores (SANDÍN-ESPAÑA y col., 2003) por lo que es el parámetro más adecuado para el estudio de fitotoxicidad y se empleó posteriormente para obtener las curvas dosis-respuesta en ambos herbicidas.
En el caso del tepraloxidim el crecimiento de raíz se redujo significativamente entre un 15% y un 95% para dosis de 2 y 32 ppb respectivamente comparadas con el control.
En el caso del tralkoxidim la reducción fue entre un 20 y 95% para dosis entre 4 y 32 ppb. Con respecto a la parte aérea, dosis tan reducidas no producen efecto fitotoxico en las plantas de trigo, excepto en la dosis máxima empleada en el tepraloxidim de 32 ppb.
El parámetro del crecimiento de raíz se empleó en el cálculo de las curvas dosis respuesta para cada herbicida mediante regresión no lineal ajustando al modelo logístico; dónde C es el límite inferior, D es el límite superior, b es la pendiente de la curva en el punto de inflexión de la curva y EC50 es la concentración de herbicida que produce una reducción de la variable considerada del 50% respecto del testigo (Figura 2).
Para realizar todos los análisis estadísticos se utilizó el programa estadístico Statgraphics Plus v 2.0 (Statgraphics, 1996). Los parámetros estimados del modelo logístico se presentan en la Tabla 4, donde se observa un buen ajuste de los resultados obtenidos, con un coeficiente de correlación superior al 97% en todos los casos, por lo que se consideran ensayos repetitivos con una baja variabilidad. El efecto fitotóxico de los herbicidas se observó visualmente en una deformación de las plantas, con un acortamiento de la raíz principal y una disminución de las raíces secundarias. La reducción de crecimiento al 50% (CE50) producida por el tralkoxidim fue superior al producido por el tepraloxidim en el cultivo de trigo. Como conclusión, la presencia de estos productos en dosis muy bajas del orden de 2 ppb en el caso del tepraloxidim y 4 ppb en el tralkoxidim producen efectos fitotóxicos en el parámetro más sensible estudiado que fue crecimiento de raíz en el cultivo de trigo.
La elevada sensibilidad de los ensayos biológicos nos permite detectar de manera rápida y sencilla fototoxicidad en cultivos sensibles a los herbicidas.
Agradecimientos.
Este trabajo forma parte del proyecto de investigación RTA 01-034 del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria (INIA). La doctora Pilar Sandín fue becaria predoctoral del INIA durante la realización de este estudio.
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