INTRODUCCIÓN
La aplicación de sustancias externas al cultivo para el control de plagas y enfermedades ha sido una de las prácticas más comunes desde el inicio de la agricultura. Algunos escritos del siglo XVIII reportan ya la aplicación de extractos de piretrum, sulfatos, arsénico e incluso plomo para controlar enfermedades de los cultivos (MONTESINOS, 2006). Hoy en día, un gran número de formulaciones se evalúan cada año como posibles agentes de control de enfermedades causadas por hongos o bacterias.
Una alternativa al uso de agroquímicos sintéticos para el control de plagas y enfermedades en los cultivos agrícolas es la aplicación de extractos vegetales procedentes de flores, hojas, raíces, tallos e incluso semillas (PÉREZ et al., 2003). Los plaguicidas naturales más conocidos son aquellos que se utilizan para controlar insectos (CUBILLO, et al., 1999, IANNACONE & LAMAS, 2003; IANNACONE & REYES, 2001) y nematodos (INSUNZA & VALENZUELA, 1995; OKA et al., 2000; PÉREZ et al., 2003; RODRIGUEZ-KABANA et al., 1992, 1995). Menos frecuente es la información que hace referencia al control de enfermedades causadas por hongos y bacterias fitopatógenas mediante la aplicación de extractos vegetales (ELKAFFASH W. M. & AL-MENOUFI O. A., 1998; RANASINGHE et al., 2002, 2003; STTAUFFER, et al., 2000).
A pesar de que se ha aislado muchos compuestos con actividad fungicida-bactericida procedentes de vegetales tales como glucosinolatos, fenoles, poliacetilenos, diterpenos, sesquiterpenos, entre otros (PÉREZ, et al 2003), resulta complicado aislar los efectos de sus compuestos de manera individual (por cromatografía líquida la mayoría de las veces) además de ser económicamente costosos. Debe resaltarse que solamente evaluando el extracto completo se puede valorar su verdadero efecto biocida, ya que de este modo se considera el efecto de los ingredientes individuales y la posible sinergia entre ellos.
Se han probado numerosas técnicas para determinar la acción biocida o biostática de productos con múltiples compuestos sobre agentes fitopatógenos.
Entre las más utilizadas está la expansión radial, la inhibición por sustrato, la inhibición de la capacidad germinativa (RANASINGHE et al., 2002; SEMPERE & SANTAMARIA, 2006; STAUFFER et al., 2000), entre otras.
En este trabajo se ha puesto a punto una metodología in vitro que permite evaluar las propiedades biocidas y/ó biostáticas de compuestos complejos (tipo extractos). El objetivo de este estudio era desarrollar un procedimiento que permitiera discernir si una concentración particular de un producto ejercía una acción biocida (elimina las unidades reproductivas) o bioestática (inhibe el crecimiento pero no elimina las unidades reproductivas) sobre un determinado microorganismo fitopatógeno (hongo o bacteria).
Materiales y métodos
Para la puesta a punto de esta metodología, se utilizaron 3 dosis de un producto basado en extracto de cítricos que en experiencias preliminares había evidenciado una posible acción fungicida y bactericida.
De esta manera se incorporó el extracto al medio de cultivo de un hongo fitopatógeno (Ensayo 1) y de una bacteria fitopatógena (Ensayo 2) ampliamente conocidos, y se compraron frente a un testigo sin tratar y un tratamiento con un fungicida y un bactericida comercial.
Microorganismos patógenos:
En el primer ensayo se evaluó el efecto del extracto sobre Fusarium oxysporum f. sp lycopersici (Sacc.) W.C. Snyder & H.N. Hans., (aislamiento FEAD 0512). Fo es un hongo patógeno del suelo de la clase Hifomicetes, que causa marchitez especialmente en plantas de tomate en todo el mundo, especialmente en climas cálidos. En un segundo ensayo, se seleccionó la bacteria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi (= Pseudomonas solanacearum) (cepa FEAD 0511) proteobacteria responsable de la podredumbre parda de numerosos cultivos. Ambas cepas pertenecen a la colección de cultivos mantenida en el laboratorio de Investigación y Desarrollo de FuturEco BioScience S.L.
Formulaciones con actividad biocida:
- Standard (productos químicos).
Ensayo 1. Control positivo para la evaluaciónde Fo: Cuproxat® (de Kenogard). Fungicida comerciala base de oxicloruro de cobre (al 19%) en forma de suspensión concentrada para aplicación foliar.
Ensayo 2. Control positivo para la evaluación de Rs: Kasumin® (de Lainco). Bactericida comercial (polvo mojable) cuya formulación se compone de un 45% de oxicloruro de cobre y un 5% de kasugamicina.
- Extracto Vegetal.
En ambos ensayos se evaluó la actividad biocida de un extracto procedente de semillas de cítricos:
Bestcure®, (de FuturEco BioScience). Fertilizante con 6% de L-aminoácidos, en el que se ha observado cierta acción fungicida-bactericida en ensayos anteriores (MANSILLA et al., 2004).
Validación:
A partir de un cultivo de 7 días de Fusarium oxysporum FEAD 0512 (Fo)sobre medio PDA estéril se obtuvo una suspensión de 1,7 x 107 esporas/mL.
Se inoculó 1 mL de la suspensión en 4 matraces de 150 mL y a dos de ellos se les adicionó oxicloruro de cobre (19%) ajustando a una concentración de 1% (máxima recomendada). Los matraces inoculados se incubaron en agitador orbital a 25ºC, 100 rpm durante 96 horas. Al cabo de este tiempo se determinó la concentración total de biomasa (filtración + desecación hasta peso constante), la concentración final de esporas de Fo y las UFCs. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 1.
Evaluación de extracto de semillas:
Se realizaron dos ensayos independientes. En el primero se evaluó la capacidad fungicida-fungistática de un extracto de cítricos sobre Fo mientras que en el segundo se determinó la capacidad bactericidabacteriostática de ese mismo extracto sobre Rs. Cada uno de los ensayos se realizó por duplicado.
Ensayo 1: Se incubaron 10 placas de un cultivo de Fo para obtener el inóculo patrón. Se raspó la superficie de las placas y se recogió el material en una solución de polisorbato 80 al 0,1% estéril. La suspensión resultante se filtró a través de una doble capa de gasa estéril para separar los fragmentos de micelio y esporas germinativas, intentando obtener un inóculo basado exclusivamente en unidades reproductivas no germinadas (esporas y células bacterianas).
Usando la cámara de Neubauer, se realizó un recuento de las esporas y paralelamente se determinó el número de Unidades Fomadoras de Colonia (UFCs) para conocer la concentración inicial. El inóculo resultante se ajustó a 1,0 x106 UFC/mL. Se seleccionaron tres dosis comercialmente aceptables del extracto de cítricos (Bestcure®) 0,075%, 0,15% y 0,3% v/v, y se preparan soluciones del producto sintético standard aplicando una dosis doble de la máxima recomendada (Cuproxat® al 2%). En cada matraz se incorporaron 100 mL de caldo de cultivo (Caldo Saboreaud, Liofilchem, Italia), 1 mL de la suspensión del inóculo y las cantidades necesarias de Bestcure® y Cuproxat® para ajustar las dosis seleccionadas.
Los matraces se incubaron durante 96 h a 25ºC a 100 rpm en un agitador orbital (Gallenkamp).
Ensayo 2: De manera similar al Bioensayo 1, se incubaron 10 placas de un cultivo de Rs para obtener el inóculo patrón. La suspensión resultante del raspado, se filtró y se determinaron UFCs. El inóculo resultante se ajustó a 8,0 x1010 UFC/mL. Se utilizó Kasumin® al 1,5% como producto sintético standard.
En cada matraz se incorporaron 100 mL de caldo de cultivo (Medio King: 15 g/l agar; caseina peptona 20 g/L; K2HPO4 1,5 g/L; MgSO4 7 H2O 1,5 g/L; glicerol 15 mL/L; pH 6,8)), 1 mL de la suspensión del inóculo (Rs) y las cantidades necesarias de Bestcure® y Kasumin® para ajustar las dosis seleccionadas. Los matraces se incubaron durante 48 h a 30ºC a 100 rpm en un agitador orbital.
Determinaciones:
Al finalizar el periodo de incubación en ambos ensayos,se filtró al vacío en un kitasato el contenido de los matraces, empleando papel Whatman Nº1, y los filtros se secaron hasta peso constante en estufa (Selecta). En cada ensayo se incorporaron dos controles sin incubar, que se filtraron inmediatamente después de la inoculación para determinar el contenido de biomasa inicial.
Con el contenido de biomasa encontrado se calculó el % de inhibición (I) aplicando la fórmula (RANASINGHE et al., 2002):
% I = ((PMc ? PM0) ? (PMt ? PM0)) / (PMc ? PM0) *100
PMc = Biomasa obtenida en el control
PM0 = Biomasa inicial (control sin incubar)
PMt = Biomasa obtenida en los tratamientos
De acuerdo con las concentraciones utilizadas se calculó la concentración capaz de producir al menos un 90% de inhibición en la capacidad de crecimiento de cada microorganismo (CMI).
Previo a la filtración de cada uno de los matraces, al final del periodo de incubación, se separó 1 mL de cultivo en condiciones estériles. A partir de éste se hicieron soluciones seriadas y se determinó el Número de Unidades Formadoras de Colonias / mL (recuento de viables) de cada uno de los patógenos.
Resultados y discusión
Bestcure®, el extracto de cítricos evaluado, presentó actividad fungicida a las dosis ensayadas sobre Fo (Tabla 2) y bactericida a las mismas dosis sobre Rs (Tabla 3).
Los resultados de esta técnica sirven para dilucidar de forma global si un producto determinado posee una acción biocida o bioestática sobre un microorganismo patógeno en un tiempo promedio de una semana. Incluyendo un número suficiente de concentraciones es posible conocer la concentración mínima inhibitoria y la dosis letal 50 (DL50), que son datos de partida para el diseño de ensayos posteriores de semi-campo y campo.
Este método resulta suficientemente viable, cuando se aplica a patógenos bacterianos o fúngicos, con una respuesta de efecto suficientemente diferente a la del control que permite observar efectos concluyentes del tipo SI o NO. Aunque la eficacia de un determinado producto debe validarse en condiciones in vivo, al menos este método proporciona una base para descartar productos no eficaces.
Es una metodología sencilla, que permite ser adaptada en un laboratorio de microbiología básico.
Esta herramienta de análisis, gracias a su flexibilidad, se ha convertido en un método de análisis interno estandarizado en el laboratorio de Investigación y Desarrollo de FuturEco BioScience, SL.
BIBLIOGRAFÍA
CUBILLO, D.; SANABRIA, G.; HILJE L. (1999). Evaluación de la repelencia y mortalidad causada por insecticidas comerciales y extractos vegetales sobre Bemisia tabaci. Manejo Integrado de Plagas (Costa Rica) 53: 309-315.
ELKAFFASH W. M.; AL-MENOUFI. (1998). Evaluation of plant aquosus extracts for their antifungal activity against certain phytopathogenic fungi. Phytopathology 88, 25.
IANNACONE, J.; LAMAS, G. (2003). Efecto insecticida de cuatro extractos botánicos y del cartap sobre la polilla de la papa Phthorimaea operculella (Zeller) (Lepidoptera: Gelechiidae), en el Perú. Entomotrópica, 18 (2): 95-105.
IANNOCONE, J.; REYES, M. (2001). Efecto de las poblaciones de Bemisia tabaci (Homóptera: Aleyrodidae) y Liriomyza huidobrensis (Díptera: Agromyzidae) por los insecticidas botánicos neem y rotenona en el cultivo de tomate en el Perú. Rev. Col. Entomol 27: 147-152.
INSUZA, V.B.; VALENZUELA, A.A. (1995). Control of Ditylenchus dipsaci on garlic (Allium sativum) with extracts of medicinal plants from Chile. Nematropica, 25 (1): 35-41.
MANSILLA, P.; PÉREZ, R; FERNANDEZ, C. (2004). Ensayo preliminar de control de mildiu de la vid con Bestcure. Vida Rural, 15 abril: 67.
MONTESINOS, E. (2006). Una mirada al fenómeno de la resistencia a funguicidas y bactericias. Comunicación Técnica, Boletín Empresarial LA HOJA, FuturEco, SL. Febrero de 2006. (www.futureco.net)
OKA, Y.; NACAR, S; PUTIEVSKY, E.; RAVID, UZI, YANIV, Z.; SPIEGEL, Y. (2000). Nematicidal Activity of essential oils and their components against the root-knot nematode. Phytopathology, 90:710-715.
PÉREZ, M.P.; NAVAS-CORTÉS, J.A.; PASCUAL-VILLALOBOS, M.J.; CASTILLO, P. (2003). Nematicidal activity of essential oils and organic amendments from Astereceae against root-knot nematodes. Plant Pathology, 52: 395-401.
RANASINGHE, L.; JAYAWARDENA, B; ABEYWICKRAMA K. (2002). Fungicidal activity of essential oils of Cinnamonum zeylanicum (L.) and Sygyzium aromaticum (L.) Merr et L.M. Perry against crown rot and anthracnose pathogens isolated from banana. Letters in Applied Microbiology, 35: 208-211.
RODRÍGUEZ-KABANA, R.; PINOCHET, J.; CALVET, C. (1992). El orujo de aceituna para el control de nematodos fitoparásitos. Nematrópica, 22 (2) 149- 158.
RODRÍGUEZ-KABANA, ESTAUN, V.; PINOCHET, J.; MARFA, O. (1995). Mixtures of Olive Pomace with different nitrogen sources for the control of Meloidogyne spp. on tomato. Journal of Nematology 27 (4S): 575-584.
SEMPERE, F., SANTAMARINA, M.P. (2006) Estudio de la respuesta a distintas condiciones medioambientales del agente responsable de la fusariosis del arroz: Fusarium verticilloides (Sacc.) Nirenberg. PHYTOMA, 182: 122-125
STAUFFER, A., ORREGO A. F., AQUINO A.J. (2000). Selección de extractos vegetales con efecto fungicida y/o bactericida. Revista de Ciencia y Tecnología, Dirección de Investigaciones ? UNA. Vol 1 (2): 29-33.
