Materiales y métodos
Material vegetal. La toma de muestras de los frutos de Zizyphus jujuba (Foto 1) se realiza directamente de los árboles situados en Valencia (España).
Ensayo de atracción. Los ensayos de atracción se realizan con moscas criadas en un insectario. Las condiciones ambientales que se utilizan son constantes; el fotoperíodo es de 16:8 (luz: oscuridad), con 26 ± 1ºC de temperatura y un 60±10% de humedad relativa. Los adultos de C. capitata se alimentan de una mezcla de autolisado de levaduras (Sigma, Madrid) y sacarosa en proporción 1:4 (p/p). Mientras que las larvas se alimentan con una mezcla de salvado de trigo, levadura de cerveza, sacarosa, nipagín, nipasol, agua y ácido clorhídrico (20:5:1:0.5:0.5:10:0.1) en peso.
La colonia de C. capitata se mantiene en jaulas de metacrilato de 30*30*20 cm. (Foto 2) donde permanecen las moscas durante su fase de adulto. Las hembras ponen los huevos a través de una malla situada en uno de los laterales de la jaula. Los huevos caen en una bandeja con agua de donde se recogen por medio de una pipeta
Pasteur y se siembran sobre una dieta artifi cial donde eclosionan y se desarrollan. Cuando va a finalizar el desarrollo de las larvas y se han completado las mudas, la bandeja con dieta larvaria se sitúa en una bandeja con tierra para que las larvas salten y se entierren para formar la pupa. Estas pupas son las que se recogen para introducirlas en una nueva jaula donde volverán a salir los adultos que formarán la nueva generación.
Las jaulas son metálicas de 30x30x30cm (Foto 2), con las paredes laterales de malla metálica de 1mm, base metálica y con una tapa de metacrilato para facilitar el acceso para la limpieza. En uno de sus laterales tiene una abertura con una manga de tela, que permite el manejo de las moscas.
Los ensayos se realizan con moscas de 2 días y de 5 días. Para comprobar la atracción en las moscas jóvenes (moscas de 2 días) y en moscas adultas (moscas de 5 días), se retira la comida de la jaula el día 1 y el día 4 respectivamente.
Se realizan 3 repeticiones de cada ensayo y un control con agua. Para ello se introducen 30 machos y 30 hembras en cada jaula; en total empleamos 4 jaulas cada día que se realiza un ensayo de atracción.
Las moscas permanecen durante 1 hora en la zona de ensayo para que se aclimaten a las nuevas condiciones ambientales y evitar el estrés que les causa la captura y el traslado del insectario a la zona del ensayo.
Después, se introduce una placa petri en cada jaula; en la jaula 1 se pone un algodón dental o cotton-wick empapado en agua, que servirá como control para los ensayos, para comparar la atracción existente hacia la fruta y hacia un atrayente sin aromas pero húmedo. Las jaulas 2, 3 y 4 contienen una pieza de la fruta madura en cada placa.
Una vez que las moscas entran en contacto con la fruta, se dejará media hora para que se habitúen a los componentes volátiles de las frutas, y a partir de ahí se harán recuentos de todas las jaulas cada 10 minutos, se anotan los machos y las hembras que están colocadas encima del fruto, y también el número de moscas muertas.
Ensayo de aireación para la obtención de
volátiles
Para obtener los volátiles de los frutos, la fruta se coloca en un cilindro de vidrio abierto conectado por uno de los extremos a un generador de aire cero y por el otro extremo está conectado a un tubo de desorción térmica de 8 cm x 0.6 cm de diámetro interno relleno con 200 mg de Tenax TA como absorbente.
Antes de airear una muestra se hace pasar "aire cero" por el cilindro con un fl ujo de 1 L/ min durante 5 min, para airear el cilindro y que no contenga restos de anteriores muestras analizadas; el volumen será de 5 L.
Una vez introducida la fruta en el cilindro, se mantiene el fl ujo de corriente a 1 L/min durante 3 min. Pasado ese tiempo se coloca el tubo de muestra en el extremo del cilindro y se reduce el fl ujo a 0.1 L/ min. El tiempo de toma de muestra se mantiene durante 30 minutos.
Este proceso se repite simultáneamente 4 veces, cuatro con el fruto entero y otras cuatro con el fruto partido.
Análisis de los compuestos volátiles
Los compuestos adsorbidos en los tubos de Tenax se analizaron mediante desorción térmica unida a cromatografía de gases y espectrometría de masas (TD/GC/MS).
La desorción térmica se realizó bajo las siguientes condiciones:
- Desorción primaria de la muestra: La muestra era sometida a 300ºC de temperatura durante 10 minutos, haciendo pasar por el tubo, durante ese tiempo, un fl ujo de Helio de 100 mL/min. El split de entrada era de 1,5 mL/ min, intentando que fuera el mínimo posible
para evitar la pérdida de muestra.
- La muestra extraída del tubo queda retenida en una "trampa fría" de cuarzo rellena de Tenax TA®, que permanece durante la desorción primaria a una temperatura de ?30ºC.
- Una vez finalizada la desorción primaria, se inicia la desorción secundaria. Ladesorción secundaria consiste en desorberla "trampa fría", la cual se somete a un fuertecalentamiento, de forma que en pocos segundospasa de ?30ºC a 300ºC, con un fl ujo de Helio de21 mL/min (el fl ujo de la desorción secundariaviene determinado por el split de salida más elfl ujo de la columna, los cuales están prefi jadosa 20 y 1 mL/min respectivamente). El split desalida se ha prefi jado a 20 mL/min porque
en pruebas preliminares se ha comprobado que es el fl ujo mínimo necesario para extraer este tipo de sustancias de la trampa. Una vez termina la desorción secundaria, la muestra se introduce automáticamente en el cromatógrafo de gases a través de la línea de transferencia, que permanece a una temperatura de 250ºC.
Las condiciones del cromatógrafo son: Columna (ZB 5, 30m x 0,25 ìm) y programa de temperaturas: 40ºC / 3 min / 3ºC min-1/ 60ºC / 0 min / 6ºC min-1 / 160ºC / 0 min / 12ºC min-1 / 260ºC / 5 min).
El detector de masas es un detector de Impacto Electrónico, programado para que haga un Full Scan de entre 35 y 300 UMA, durante el tiempo de obtención del cromatograma, que en este caso es de 40 minutos, de forma que procese todas las sustancias que entran en el detector en ese tiempo.
Tratamiento estadístico de los resultados
El estudio se ha hecho con valores normalizados y con valores logarítmicos. Esto se debe a que los datos de la atracción no se distribuyen normalmente; observando la distribución de los datos en papel probabilística normal, se ve que la distribución de los datos es de tipo logarítmica, con lo cual se aplica la transformación X = lg (x+1), siendo X la variable de atracción. Con X se obtiene una distribución normal, y entonces se puede aplicar la ANOVA. La ANOVA nos proporciona la estadística, y la No ANOVA las medias y el error estándar.
Resultados y discusión
Ensayos de atracción
Los resultados de los ensayos de atracción se han estudiado estadísticamente empleando valores normalizados y valores logarítmicos, ya que los datos de atracción no se distribuyen normalmente sino que siguen una distribución logarítmica. Se observa (Figura 1) que tanto en hembras jóvenes como en adultas, la atracción es muy significativa, con niveles muy elevados. En el caso de hembras maduras (Df = 1/82, F = 49.92, P = 0.0000) los niveles de atracción de los dos atrayentes son ligeramente más elevados que en hembras jóvenes (Df=1/82, F = 30.16, P = 0.0000), pero la diferencia de atracción entre ambos es la misma en los dos estudios. La diferencia de atracción de los machos de cinco días (Df = 1/82, F=11.59, P = 0.0010) es mayor que la de los machos de dos días (Df = 1/82, F=5.88, P = 0.0175), pero en ninguno de los dos casos existe una atracción con la que se pueda decir que los compuestos del azufaifo son significativos para los machos (Figura 2).
En el estudio de las moscas totales atraídas (Figura 3) vemos que sí existen diferencias en la atracción dependiendo de la edad. En el caso de moscas de mayor edad (Df = 1/82, F = 76.27, P = 0.0000) hay una diferencia ligeramente mayor que en moscas jóvenes (Df = 1/82, F = 25.74, P = 0.0000).
Así, la atracción que ejerce la fruta (azufaifo) es más elevada en las moscas de mayor edad, además de ser mucho mayor en hembras que en machos (Tabla 1).
Si comparamos los valores de atracción con la edad de las moscas, se observa que existe una mayor atracción en moscas maduras que en moscas jóvenes. Esto es debido a que las moscas de cinco días son sexualmente maduras y se ven atraídas en mayor medida por los compuestos de las frutas que las moscas que no han alcanzado todavía su madurez sexual (Figura 4). Dependiendo del sexo, existe una gran diferencia entre los niveles de atracción de las hembras y machos, siendo las hembras las más atraídas. Los machos sin embargo no presentan atracciones significativas (Tabla 2).
Identificación de los compuestos volátiles
del azufaifo
Los compuestos volátiles se obtienen introduciendo las piezas de fruta, entera o partida, en unos tubos de cristal que están unidos por un lado a los flujómetros y por el otro a unos tubos rellenos de Tenax TA donde se recogen los volátiles y se procede a su desorción en el cromatógrafo gases- masas. La identifi cación se realiza por comparación de los espectros de masas de los productos con la biblioteca virtual NIST MASS Spectral Database y la comprobación con patrones. Se han identificado 14 compuestos (Tabla 3).
En los frutos estudiados, tanto partidos como enteros, encontramos la presencia de compuestos de reconocido poder atrayente para Ceratitiscapitata (HERNÁNDEZ-SÁNCHEZ, G et al. 2001).
La atracción del azufaifo se puede deber, entre otros factores, a los compuestos volátiles que emiten las frutas, así como a la concentración en la que se encuentran esos volátiles. Si bien es cierto que se han identificado 14 compuestos, es necesario considerar la existencia de otros que no se han identificado en este trabajo y que también pueden tener actividad atrayente. Existen otros factores, como son el color del fruto, la temperatura y la humedad relativa, cuya influencia sobre la atracción es conocida. En este estudio, la variabilidad de temperatura y humedad no han sido factores influyentes dado que los ensayos se realizaron en la misma época del año y con unas condiciones ambientales muy similares.
Conclusiones
En este trabajo se ha comprobado que el azufaifo (Ziziphus jujuba) presenta actividad atrayente sobre Ceratitis capitata.
Las hembras de Ceratitis capitata son más atraídas que los machos. La atracción que ejercen la fruta es más elevada en las moscas de mayor edad, es decir, cuando la mosca de la fruta está en la etapa de madurez que en su estadío joven, pero la atracción no sólo depende del sexo o del período de madurez de Ceratitis capitata, sino también de factores ambientales, y principalmente de los compuestos volátiles que contienen las frutas y la madurez de éstas, ya que condiciona, entre otras cosas, su composición en volátiles.
En el azufaifo se ha detectado la presencia de compuestos volátiles con reconocida actividad atrayente, lo que justificala atracción de la mosca por esta fruta.
Entre los volátiles detectados en los distintos frutos es de destacar la presencia de 2,4-dimetilheptano, (E)-2-hexen-1-ol y 1-hexanol. Estos compuestos pueden ser los principales responsables de la atracción que presenta. La formulación de estos compuestos en soportes adecuados permitirá su estudio en laboratorio y posterior utilización en campo.
Los resultados obtenidos invitan a avanzar en esta línea de investigación dada la futura aplicabilidad de los resultados de estos trabajos en el desarrollo de nuevas estrategias de control de plagas más eficaces y sostenibles. La mayoría de ellas basadas preferentemente en la obtención de atrayentes más efectivos.
BIBLIOGRAFÍA
CASAÑA-GINER, V., GANDIA-BALAGUER, A., HERNÁNDEZ-ALAMOS, M. M., MENGOD-PUERTA, C., GARRIDO-VIVAS, A., PRIMO-MILLO, J., y PRIMO-YÚFERA E. (2001).
Attractiveness of 79 compounds and mixtures to wild Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) in fi eld trials. Journal of Economic Entomology. 94: 898-904
HEATH, R. R., EPSKY, N. D., DUEBEN, B. D., RIZZO, J., y JERONIMO, F. (1997). Adding methyl-substituted ammonia derivatives to a food-based synthetic attractant on
capture of the Mediterranean and Mexican fruit fl ies (Diptera: tephritidae). Journal of Economic Entomology. 90:1584-1589.
HERNÁNDEZ-SÁNCHEZ, G., I. SANZ-BERZOSA, I, CASAÑA-GINER, V. y PRIMO-YÚFERA, E. (2001). Attractiveness for Ceratitis capitata (Wiedemann) (Dipt., Tephritidae) of mango
(Mangifera indica, cv. Tommy Atkins) airborne terpenes. En Blackwell WissenschaftsJournal-Verlag (Eds.), Applied Entomology-Zeitschrift fur Angewandte Entomologie
125:189-192.
LIQUIDO, N.J., BARR, P.G. and CUNNINGHAM R.T. (1997). Medhost: an encyclopaedic bibliography of the host plants of the Mediterranean fruit fl y, Ceratitis capitata
(Wiedemann) (electronic database/program). ARS-144.USDA-ARS, Washington DC.
NAVARRO, V.; SANCHIS, J.; y PRIMO-YÚFERA E. (2003). Un nuevo método de lucha contra Ceratitis capitata (Wiedemann): la quimiesterilización. Levante Agrícola: Revista
internacional de cítricos, ISSN 0457-6039, Nº. 364: 68-74
NAVARRO, V. (2009). La técnica de atracción y muerte: una apuesta de futuro para reemplazar el trampeo masivo. PHYTOMA España: La revista profesional de sanidad vegetal,
ISSN 1131-8988, Nº 213: 45-46
