La citricultura española ha estado condicionada a lo largo de su historia por la presencia de enfermedades graves. A finales del siglo XIX se inició la primera expansión de las plantaciones comerciales. Las variedades se injertaban sobre los portainjertos naranjo dulce, limonero, cidro o naranjo amargo. En 1892, cuando existían unas 4,000 ha de cítricos, se observaron los primeros ataques del hongo Phytophthora sp., que en 10-15 años causó la muerte de todos los árboles existentes, excepto los que estaban injertados sobre el portainjertos naranjo amargo, que es tolerante al mismo. Además, este portainjertos tiene un excelente comportamiento agronómico, por lo que a partir de entonces se utilizó de forma exclusiva en todas las nuevas plantaciones. A principios del siglo XX ya existían unas 18,000 ha y una parte importante de la producción se exportaba a diversos países europeos. La rentabilidad y expectativas del cultivo hicieron que en periodo 1910-1930 se realizase la importación de variedades de diversos países que permitieron una importante renovación varietal y una producción mas adaptada a la demanda. Sin embargo, estas importaciones se realizaron sin controles sanitarios, entre otras razones porque en esa época se desconocía la presencia en cítricos de enfermedades causadas por virus y otros patógenos transmisibles por injerto. En 1930 ya se describen los primeros síntomas de algunas virosis y en 1956 se observaron las primeras muertes de árboles causadas por el virus de la tristeza de los cítricos (CTV), que se transmite por pulgones y causa la muerte de naranjos y mandarinos injertados sobre naranjo amargo. La enfermedad se difundió rápidamente causando daños muy importantes en las plantaciones y a finales de la década de los años 60 la amenaza de un grave desastre socioeconómico se hizo muy evidente. En esa época la exportación de cítricos era la principal fuente de divisas para el país, lo que añadía una problemática adicional.
La citricultura estaba tan seriamente amenazada que para paliar en lo posible esta situación se adoptaron diversas medidas legales a partir de 1968, que cambiaron drásticamente los sistemas de producción de plantas de vivero. Se prohibió la utilización de naranjo amargo como patrón de naranjos y mandarinos en las nuevas plantaciones y se introdujeron diversos patrones tolerantes a la tristeza. Tan sólo el citrange Troyer y el mandarino Cleopatra dieron resultados aceptables en los primeros ensayos realizados. Se aprobaron procedimientos detallados para la producción de plantones, como la ausencia de tristeza en todas las fases de producción, la identificación de patrones y variedades con códigos de colores que aún están en vigor, el etiquetado individual de cada planta con datos de la variedad, el patrón, el estado sanitario y el vivero de producción. Finalmente, se adoptaron varias regulaciones relacionadas con la autorización de actividad de los viveros de cítricos, que debían estar localizados al menos a 50 km de zonas afectadas por tristeza y cumplir diversas condiciones técnicas, entre las que destacaba la exigencia de una capacidad potencial para producir un mínimo de 300.000 plantones al año. Estas medidas provocaron una reducción drástica del número de viveros, que pasaron de varios miles a sólo nueve legalmente autorizados para la producción de plantones.
Los primeros trabajos de prospección y diagnóstico de patógenos mostraron que, además de la tristeza, existían otras enfermedades causadas por virus y otros agentes transmisibles por injerto ampliamente difundidas en la citricultura española, como la exocortis, la cachexia-xyloporosis, la psoriasis, la impietratura y el concave gum, que causaban daños adicionales importantes y limitaban la utilización de los patrones tolerantes a tristeza que mejor se adaptaban a los distintos suelos y condiciones de cultivo. Así, la exocortis impedía la propagación de las variedades infectadas sobre citrange Troyer y la presencia de la cachexia-xyloporosis en limoneros impedía la utilización del Citrus macrophylla como patrón de los mismos. La situación se agravaba porque se comprobó que todas las variedades existentes estaban infectadas por diversos patógenos, entre los que siempre estaba presente la exocortis. En estas circunstancias, el problema de las diversas virosis que afectaban a los cítricos adquiría proporciones de gran envergadura y se constituía en el principal condicionante de nuestra citricultura. De hecho, la tristeza ha producido la muerte de más de 40 millones de árboles injertados en naranjo amargo (CAMBRA y col., 2000) y el resto de las enfermedades producidas por patógenos transmisibles por injerto producía pérdidas estimadas e el 10-25% de la producción, además de limitar el uso de patrones.
A principios de los años setenta la citricultura ocupaba una extensión de 225.000 ha., con una producción de tan solo 2,5 millones de toneladas.
La principal limitación de la citricultura en esta época era la presencia de diversas enfermedades producidas por virus y agentes similares, que disminuían la producción y la calidad de la fruta e impedían la utilización de los patrones que mejor se adaptaban a nuestras condiciones edafoclimáticas.
La única solución factible a esta problemática era la obtención de plantas sanas a partir de plantas enfermas, pero los métodos existentes no eran eficaces para eliminar de forma rápida y eficiente todos los patógenos. Un problema adicional de la citricultura española en los años setenta era el pequeño número de variedades existentes para la propagación comercial. Muchas de las mejores variedades existentes en otros países no podían usarse, ya que la importación de varetas o plantas de cítricos estaba prohibida para evitar el riesgo de introducir nuevas plagas y enfermedades. Este riesgo podía evitarse mediante la introducción a través de estaciones de cuarentena, pero en España no existía ninguna. Además, las virosis existentes se conocían mal y los métodos de diagnostico de las mismas eran muy lentos.
Ante esta situación, el Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias (INIA), a través del Centro Regional de Investigación y Desarrollo Agrario de Levante (CRIDA 07) (actual IVIA), realizó una apuesta importante y pionera por la investigación en diversas biotecnologías con la finalidad de intentar resolver los problemas existentes. Esta opción fue posible gracias un programa de impulso y desarrollo de la investigación agraria en España financiado por el Banco Mundial, que se realizó en la década de los años setenta y principios de los ochenta. Este programa permitió establecer proyectos de investigación de vanguardia en las distintas áreas relacionadas con las enfermedades en cítricos, cuyos resultados han sido esenciales para su control.
El programa de mejora sanitaria de variedades de cítricos
Todos los análisis de la situación provocada por las diversas enfermedades coincidían en que la única solución posible para solucionar el problema era la utilización de variedades sanas injertadas sobre patrones tolerantes a tristeza en las nuevas plantaciones, necesarias para renovar la citricultura española que estaba siendo mermada rápidamente por la tristeza. El primer paso para conseguir este objetivo era la obtención de plantas sanas a partir de plantas enfermas. Las técnicas disponibles para este propósito eran la selección de plantas nucelares de variedades poliembriónicas y la termoterapia (NAVARRO Y JUÁREZ, 2005). Ambas técnicas tenían importantes limitaciones para la citricultura española. La embrionía nucelar es muy eficiente para la eliminación de patógenos, pero las plantas nucelares tienen caracteres juveniles, que tardan varios años en desaparecer para permitir el cultivo comercial de las mismas. En consecuencia, el procedimiento no era adecuado para cubrir la necesidad urgente de variedades sanas. Además, la técnica no podía utilizarse para obtener plantas sanas de clementinas, ya que no es aplicable a las variedades monoembriónicas. La termoterapia permite la obtención de plantas libres de varios patógenos y sin caracteres juveniles, pero es ineficaz para la eliminación de viroides, que causan enfermedades como la exocortis y la cachexia-xyloporosis. Dado que todas las variedades españolas estaban infectadas por viroides, el procedimiento no tenía ninguna utilidad.
Ante esta situación, se inició un proyecto de colaboración entre el actual IVIA y la Universidad de California, Riverside, con el objetivo de poner a punto una nueva técnica para la obtención de plantas sanas. El proyecto se desarrolló en el contexto del programa de desarrollo de la investigación agraria en España financiado por el Banco Mundial.
El trabajo realizado permitió poner a punto la técnica de microinjerto de ápices caulinares in vitro, que es eficaz para obtener plantas sin caracteres juveniles y libres de todos los patógenos que afectan a los cítricos (NAVARRO, 1992, NAVARRO y col., 1975, 2005).
La disponibilidad de la técnica de microinjerto permitió iniciar en 1975 el Programa de Mejora Sanitaria de Variedades de Cítricos (Figura 1) (NAVARRO, 1976): con los siguientes objetivos: a) obtención de plantas libres de patógenos mediante la técnica de microinjerto de todas las variedades cultivadas en España; b) establecimiento de un Banco de Germoplasma de Cítricos con las plantas sanas; c) distribución de material libre de patógenos a los viveros de cítricos a través de un sistema de certificación.
Aunque la propagación de cítricos en los viveros se había regulado desde 1968 (PINA Y NAVARRO, 2001), los procedimientos establecidos no eran adecuados en algunos aspectos, como el diagnóstico periódico de patógenos de los árboles origen del material de propagación o el procedimiento de incremento de yemas en los viveros. Por ello, en 1976 se estableció un nuevo reglamento de certificación de plantones de cítricos que regulaba con detalle todos los aspectos de la producción de plantas en vivero, incluyendo la propagación a través de diversos bloques de plantas y el diagnóstico periódico de enfermedades. Este reglamento se ha modificado ligeramente en los años trascurridos, fundamentalmente por la adaptación de la legislación comunitaria, pero los aspectos esenciales se han mantenido. La colección protegida del Banco de Germoplasma del IVIA es el bloque inicial de material para el sistema de certificación. Los viveros tienen que establecer sus bloques clásicos de árboles madre de base, de multiplicación de yemas y de plantones (Figura 1). De esta forma se consiguió establecer desde el principio una estrechísima colaboración entre las actividades de investigación y los viveros productores de plantas.
En el momento en el que la obtención de plantas sanas de las variedades locales estuvo en marcha, el sector productor y exportador empezó a reclamar con insistencia la introducción de variedades de calidad procedentes de otros países, lo que no podía hacerse debido a la prohibición de importar varetas de cítricos. Para resolver esta problemática se realizó un proyecto de investigación con la colaboración financiera del Comité de Gestión de Cítricos, que permitió poner a punto un nuevo procedimiento de cuarentena de cítricos basado en técnicas de cultivo de tejidos in vitro (NAVARRO y col., 1984, 2005). Básicamente consiste en el cultivo in vitro de las varetas importadas, que en 8-16 días producen brotes de la que se aíslan ápices de 0?1-0?2 mm que se microinjertan in vitro para la producción de plantas.
En la práctica sólo un pequeño ápice normalmente libre de plagas y enfermedades es introducido en el país y los patógenos que pudiera tener el material importado se eliminan en la fase inicial de la introducción. La disponibilidad de esta técnica permitió cambiar en 1982 la legislación para regular la importación de material vegetal cítricos mediante el procedimiento de cuarentena in vitro. En consecuencia, se estableció un nuevo objetivo en el Programa de Mejora Sanitaria consistente en la introducción de genotipos de otros países.
El Programa es de hecho la combinación de tres programas coordinados: Saneamiento, Cuarentena y Certificación (NAVARRO, 1993). Los tres programas son necesarios para producir plantas de vivero sanas, que es la herramienta más importante para el control de las enfermedades transmisibles por injerto (Figura 1). Cada uno de los programas es responsabilidad de una institución pública diferente. El Programa de Saneamiento es competencia del IVIA, el de Cuarentena de la Subdirección General de Sanidad Vegetal del MAPA y el de Certificación se realiza actualmente de forma compartida entre el Instituto Nacional de Semillas y Plantas de Vivero del MAPA y los Servicios competentes de las Comunidades Autónomas. Sin embargo, desde el inicio de los mismos y hasta la actualidad, ha existido una coordinación estrecha entre las instituciones implicadas, lo que permite que todas las actividades técnicas relacionadas con la eliminación de enfermedades y el diagnóstico de patógenos se realicen en el IVIA con métodos y dirección técnica comunes. Esto facilita que cualquier avance científico en estos campos se aplique de forma inmediata y rutinaria en los programas mencionados.
Además existe una excelente cooperación con los viveros, lo que asegura una rápida y eficiente distribución de material sano. El Programa de Mejora Sanitaria e Variedades de Cítricos se realiza con financiación del IVIA perteneciente a la Conselleria de Agricultura, Pesca y Alimentación de la generalidad Valenciana, del Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias (INIA) perteneciente al Ministerio de Educación y Ciencia, del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y de todos los viveros de cítricos. A continuación se realiza una exposición resumida de la situación actual de los principales aspectos del Programa.
Selección de genotipos
Inicialmente se dio prioridad a la inclusión de las variedades comerciales de mayor interés, tanto españolas como de otros países. Sin embargo el Programa evolucionó rápidamente hacia un objetivo más general con la finalidad de establecer un Banco de Germoplasma que incluyera la mayor variabilidad genética posible dentro del género Citrus e incluso de géneros afines a los cítricos. Se incluyeron todas las variedades tradicionales que se habían cultivado en España y progresivamente se están introduciendo diversos genotipos de especies silvestres de cítricos. El Banco de Germoplasma se utiliza como fuente inicial de material para la propagación comercial, pero también tiene un uso muy importante para diversos proyectos de investigación, especialmente los relacionados con la mejora genética.
La selección inicial de variedades para incluir en el Banco de Germoplasma se realiza sobre la base de criterios agronómicos y genéticos, independientemente de su estado sanitario. Para cada variedad se realiza una prospección pera seleccionar los mejores árboles disponibles. En el caso de variedades de origen reciente obtenidas por mutación espontánea en campo, se selecciona el árbol madre origen de la mutación siempre que está disponible.
Para las variedades importadas se recurre normalmente a Centros de Investigación de los países originarios, que envían material de los árboles más controlados de que disponen.
Microinjerto de ápices caulinares in vitro
La técnica del microinjerto se aplica de forma rutinaria en el programa siguiendo el procedimiento estándar (NAVARRO, 1982, NAVARRO y col., 1975, 2005). Se usa el citrange Troyer como patrón para todas las especies, sobre el que se injerta un ápice compuesto por el meristemo apical y tres primordios foliares, con un tamaño de 0?1-0?2 mm. Las plantas microinjertadas se transplantan al invernadero 4-6 semanas después del injerto in vitro normalmente con mas del 95% de supervivencia.
Se ha demostrado que la eliminación de patógenos por microinjerto se favorece cuando los brotes de los que se aíslan los ápices crecen a temperaturas relativamente altas. Por ello en el procedimiento rutinario las plantas a sanear se propagan en invernadero y se cultivan a 32ºC antes de la recolección de brotes. De forma similar, las varetas importadas a través de la estación de cuarentena se cultivan a 32ºC durante 8-16 días en una cámara de cultivo para forzar la producción de brotes.
El procedimiento de cultivo de varetas in vitro se está utilizando en la actualidad incluso para variedades seleccionadas en España, ya que es más rápido que la propagación de plantas en el invernadero y da porcentajes de prendimiento ligeramente superiores.
El procedimiento rutinario se ha usado desde 1975 con muchos genotipos pertenecientes a 45 especies de los géneros Citrus, Fortunella y Poncirus y a diversos híbridos interespecíficos e intergenéricos.
El porcentaje medio de prendimiento en este periodo ha sido del 38%, pero con diferencias considerables entre las distintas especies. Con la mayoría se obtienen prendimientos superiores al 40%, excepto en los limoneros que tienen un prendimiento alrededor del 20% y las satsumas del 30%.
La eliminación de patógenos ha sido en general muy eficiente. Los viroides, las razas suaves de tristeza, el vein enation y el concave gum han sido muy fáciles de eliminar. En toda la historia del programa ninguna de las plantas microinjertadas se ha encontrado infectada con razas suaves de tristeza o con concave gum. Sólo una planta microinjertada se encontró infectada con un viroide y otra con vein enation. La psoriasis y las razas severas de tristeza son algo más difíciles de eliminar, pero el 85% de las plantas microinjertadas están libres de estos patógenos. Recientemente se ha caracterizado un nuevo virus en cítricos denominado "Manchado foliar de los cítricos" (VIVES y col., 2002). Aunque está presente en varios países del mundo, su incidencia en los mismos es aparentemente muy baja.
Aunque debido a estas circunstancias no existen datos suficientes acerca de su eliminación por microinjerto, los resultados disponibles indican que es más difícil de eliminar que los patógenos estudiados hasta ahora.
Los datos anteriores muestran que el procedimiento rutinario de microinjerto usado en el Programa da resultados totalmente satisfactorios. El porcentaje de prendimiento es aceptable y la mayor parte de las plantas microinjertadas están libres de los patógenos que afectaban a las plantas originales.
La disminución del tamaño del ápice caulinar para incluir solo dos primordios foliares probablemente aumentaría el porcentaje de plantas sanas obtenidas, pero el porcentaje de prendimiento se reduciría drásticamente a niveles que no serían operativos en aplicaciones rutinarias.
Para el saneamiento de una variedad se obtienen varias plantas por microinjerto, pero normalmente sólo una o dos se someten inicialmente a las pruebas de diagnóstico de patógenos, lo que suele ser suficiente para obtener plantas sanas. El tiempo necesario para realizar todo el proceso es normalmente de 14 a 16 meses, incluyendo el microinjerto y el diagnóstico de patógenos de las plantas microinjertadas.
Diagnóstico de patógenos
Procedimientos. La detección de patógenos se realiza mediante métodos biológicos usando plantas indicadoras de cítricos (ROISTACHER, 1991) y varios métodos de laboratorio (Tabla 1). Los métodos biológicos consisten en la inoculación de plantas indicadoras con tejidos de la planta a analizar y su cultivo en invernadero durante periodos de 6-12 meses a la temperatura adecuada para la manifestación de síntomas específicos inducidos por los diversos patógenos (Tabla 1). El conjunto de los siete indicadores usados nos permite identificar la gran mayoría de los patógenos de cítricos.
Los métodos biológicos son muy sensibles y fiables, aunque tienen el inconveniente de su excesiva duración y elevado coste. Aunque a priori parecen muy sencillos de realizar, en la práctica son bastante complicados cuando se hacen a gran escala.
Es necesario disponer de invernaderos con control de temperatura para cultivar las plantas indicadoras antes y después de la inoculación (Figura 2). La calidad de las plantas indicadoras es esencial para garantizar resultados fiables. Deben ser vigorosas y no manifestar síntomas de deficiencias nutricionales o fitotoxicidad por aplicación de fertilizantes o pesticidas, ya que ello enmascara los síntomas producidos por los distintos patógenos.
La temperatura durante el periodo de incubación es crítica, ya que muchos patógenos sólo producen síntomas en un intervalo de temperaturas muy estrecho (Tabla 1). Para la realización del programa disponemos de un complejo de invernaderos con condiciones ambientales específicas que se dedican a distintos aspectos del mismo. Un invernadero a 18-28ºC se usa para la realización de semilleros, cultivo de plantas indicadoras y propagación de plantas para distintas necesidades. Otro invernadero a 18-25ºC, con una zona muy sombreada, se destina al trasplante y cultivo de las plantas microinjertadas. Las pruebas de diagnóstico se realizan en dos invernaderos a 18-25ºC a 27-32ºC en función de la temperatura requerida para la manifestación de síntomas (Tabla 1). El cultivo y diagnóstico de patógenos de las plantas importadas a través de la estación de cuarentena se lleva acabo en un invernadero de seguridad, en el que regulación de temperatura se realiza por sistemas de aire acondicionado y la renovación de aire con el exterior se efectúa a través de filtros que incluso impiden la salida de polen (Figura 3). Evidentemente la construcción y mantenimiento de este complejo es muy caro y además requiere mucho personal.
Otro aspecto esencial del diagnóstico biológico en la observación continua y detallada de las plantas indicadoras inoculadas. Los síntomas inducidos por varios patógenos sólo se observan en determinados momentos del desarrollo de las plantas y algunos aislados producen síntomas muy débiles.
A pesar de los inconvenientes citados, los métodos de diagnóstico biológico se han mostrado altamente fiables en los treinta años de ejecución del Programa y han permitido garantizar la sanidad de las plantas obtenidas.
Durante los primeros años del Programa los métodos biológicos eran los únicos existentes. Sin embargo, los trabajos de investigación realizados en el IVIA permitieron la puesta a punto de diversos métodos de laboratorio (Tabla 1) que son más rápidos y baratos que los biológicos y que también tienen una alta fiabilidad. En 1978 se incorporó la técnica DAS-ELISA para detección de tristeza (CAMBRA y col., 1979), sustituida paulatinamente a partir de 1995 por la técnica inmunoimpresión-ELISA (GARNSEY Y CAMBRA, 1991). En 1989 se incorporó la técnica sPAGE para el diagnóstico simultaneo de todos los viroides, incluyendo los causantes de la exocortis y la cachexia (DURAN-VILA y col., 1993) y en 1998 la técnica de hibridación de impresiones (PALACIO y col., 1998), que permite identificar individualmente cada viroide. A partir de 1995 se está usando la técnica de análisis de ácidos nucleicos de doble cadena (dsRNA) que permite detectar la presencia de virus que producen dsRNA en su ciclo de replicación, incluso en el caso de virus desconocidos (MORENO y col., 1990; VALVERDE y col., 1990). Desde el año 2001 se está usando la técnica de RT-PCR para la detección del nuevo virus del manchado foliar de los cítricos (VIVES y col., 2002) y desde 2002 la técnica ELISA para detección de psoriasis (MARTIN y col., 2002).
El Programa de Mejora Sanitaria en España ha sido pionero en la incorporación rutinaria de estos nuevos desarrollos tecnológicos de detección de patógenos, marcando una pauta a seguir en otros países.
Los métodos de diagnóstico disponibles se utilizan en las distintas fases del programa según las necesidades y grado de seguridad requeridos, tal como se indica en los siguientes apartados.
Diagnóstico de árboles seleccionados en España. Se analizan con todos los métodos indicadosen la Tabla 1, usando sPAGE para detecciónde viroides. Esta etapa nos permite identificar los patógenosque deben ser eliminados por microinjertoy a la vez nos ha permitido conocer con detalle la incidenciade las distintas enfermedades y los diferentesaislados de cada patógeno existentes en España.
Igualmente, ha permitido identificar nuevas enfermedades en nuestro país, como el vein enation (NAVARRO Y BALLESTER, 1976), un aislado de tristeza severa introducido con una importación clandestina de una satsuma del Japón (BALLESTER y col., 1988), un patógeno que induce una incompatibilidad en naranjas dulces infectadas sobre limonero Rugoso (NAVARRO y col., 1993) y una enfermedad en Kumquat posteriormente identificada como manchado foliar (NAVARRO y col., 1984; VIVES y col., 2002). El diagnóstico de los árboles seleccionados en España ha sido también la base para el establecimiento de la colección del IVIA de patógenos transmisibles por injerto, que ha sido muy importante para diversos proyectos de investigación.
Todas las variedades españolas incluidas en el programa estaban infectadas al menos con un patógeno y más del 50% estaban infectadas por tres o más patógenos. Estos datos muestran claramente las consecuencias de la propagación de material sin el control sanitario adecuado y dan evidencias adicionales del daño causado en la citricultura española por los patógenos transmisibles por injerto.
Diagnóstico de plantas microinjertadas.
Las plantas microinjertadas, tanto las procedentes de los genotipos seleccionados en España como de los importados a través de la Estación de Cuarentena, se analizan usando todos los indicadores biológicos y todas las técnicas de laboratorio disponibles, excepto la hibridación de impresiones (Tabla 1).
Hasta el momento no se han encontrado discrepancias entre los métodos biológicos y de laboratorio. Sin embargo, la duplicación de análisis para el mismo patógeno usando dos procedimientos distintos da una garantía adicional de la sanidad de las plantas obtenidas, que pueden convertirse en plantas madre de las que se propagan millones de plantones. Los análisis que se practican a estas plantas dan una garantía muy superior a la que exige legalmente el reglamento de certificación.
Diagnóstico de los bloques de propagación en el Programa de Certificación. Elprograma de certificación legalmente vigente en Españacontempla la propagación comercial de los cítricosen distintos bloques: bloque de material inicialsituado en el IVIA (Figura 4), bloques de árbolesde base que pertenecen generalmente a variosviveros (Figura 5), bloques de multiplicación de yemasubicados en cada vivero (Figura 6) y bloquede plantones (Figura 7). El sistema de certificaciónincluye las siguientes enfermedades: tristeza, veinenation, psoriasis, concave gum, impietratura, cristacortis,infectious variegation, exocortis, cachexiaxyloporosis y manchado foliar. La regulación parael control periódico de patógenos en los distintosbloques de propagación (Figura 1) depende del gradode aislamiento de los mismos. Actualmente tantoel bloque inicial de material sano en el IVIA comolos 9 bloques de árboles de base existentesen los viveros se cultivan en el interior de recintosde malla, por lo que tienen un elevado grado de aislamiento.
En esta situación, todos los árboles de estos bloques deben analizarse como mínimo cada 3 años para tristeza y vein enation (enfermedades transmitidas por pulgones), cada 3 años para exocortis y cachexia (enfermedades transmisibles mecánicamente) y cada 10 años para el resto de enfermedades que sólo se transmiten por injerto. A pesar de esta normativa, en la práctica los análisis de tristeza se realizan anualmente.
El diagnóstico se realiza mediante inoculación en plantas de lima Mexicana, tangor Dweet, naranjo Pinneaple y cidro Etrog. Además, se usa la técnica de hibridación de impresiones para la detección de cachexia-xyloporosis, PCR para la detección del manchado foliar e inmunoimpresión-ELISA para detección de tristeza. Actualmente hay alrededor de 2.000 árboles que deben someterse a este análisis periódico de enfermedades.
Las pruebas de diagnóstico de patógenos de los árboles de base, que están situados en la Comunidad Valenciana y en Cataluña, se realizan en el IVIA en el marco de la colaboración existente con el MAPA.
Los bloques de multiplicación de yemas se cultivan normalmente en túneles cubiertos, que también confieren una alta protección contra la reinfección. Estos bloques se mantienen durante un periodo de 3-5 años y se estima que en la actualidad contienen unos 250.000 árboles en los 39 viveros de cítricos existentes en nuestro país.
El 10% de estos árboles debe analizarse anualmente para tristeza mediante técnicas serológicas.
Estos análisis los deben realizar los servicios competentes de las Comunidades Autónomas donde se ubican los bloques de multiplicación (Valencia, Cataluña, Murcia y Andalucía.). Hay que resaltar que además de los controles oficiales, algunos viveros localizados en la Comunidad Valenciana analizan por sus propios medios todos los árboles de los bloques de multiplicación mediante la técnica de inmunoimpresión-ELISA, usando los estuches de diagnóstico disponibles comercialmente.
En los últimos años los viveros de cítricos están comercializando alrededor de 7 millones de plantones al año. Al menos en la Comunidad Valenciana el 0?1%-1% de estos árboles también se analizan mediante técnicas serológicas, para detectar la posible presencia de tristeza.
Banco de germoplasma
La agricultura moderna utiliza sólo unas pocas variedades seleccionadas de alto rendimiento y calidad para cada cultivo. Ello ha llevado al abandono de las variedades tradicionales. Además, las deforestaciones incontroladas y el avance imparable de las ciudades y zonas industriales están ocasionando la perdida de muchas especies silvestres relacionadas con las cultivadas. Esta situación provoca una fuerte erosión y perdida de recursos fitogenéticos que son el fruto de miles de años de evolución y que contienen los genes o combinaciones de genes relacionados con resistencia a plagas, enfermedades, situaciones ambientales adversas (salinidad, sequía, temperaturas extremas, etc), producción, composición de los alimentos, etc. Durante el pasado siglo se fue creando una concienciación creciente sobre la necesidad de conservación de estos recursos, que son esenciales para garantizar un desarrollo agrícola sostenible para las generaciones presentes y futuras, ya que los recursos fitogenéticos para la alimentación y la agricultura son la materia prima indispensable para el mejoramiento genético de los cultivos, por medio de la selección de los agricultores, la mejora clásica o las biotecnologías modernas, y son esenciales para la adaptación a los cambios imprevisibles del medio ambiente y las necesidades humanas futuras.
El establecimiento de políticas globales para la conservación y utilización de los recursos fitogenéticos ha ocasionado durante años un fuerte debate y confrontación política entre países, que finalmente han llegado a un acuerdo con la firma en 2001 del Tratado Internacional de Recursos Fitogenéticos para la Alimentación y la Agricultura, que tiene como objetivos fundamentales "la conservación y la utilización sostenible de los recursos fitogenéticos para la alimentación y la agricultura y la distribución justa y equitativa de los beneficios derivados de su utilización en armonía con el Convenio sobre la Diversidad Biológica, para una agricultura sostenible y la seguridad alimentaria".
A nivel internacional la FAO tiene una política muy activa en este campo y existe el Instituto Internacional de Recursos Genéticos de Plantas (IPGRI), que dedica toda su actividad a la conservación de recursos fitogenéticos en los cinco continentes.
Además, muchos países, entre los que se incluye España, tienen programas nacionales de conservación de recursos fitogenéticos en redes de Bancos de Germoplasma de las especies de más interés para los mismos.
El Banco de Germoplasma de Cítricos se enmarca en este contexto y se ha convertido en un objetivo fundamental del Programa de Mejora Sanitaria.
Los cítricos son originarios del sudeste asiático, donde se encuentra la mayor variabilidad de los mismos y las especies silvestres fuertemente amenazadas de extinción. La citricultura moderna de todos los países se basa en la utilización de muy pocos patrones y variedades seleccionados por su calidad, rendimiento y tolerancia a estreses bióticos y abióticos concretos. Ello provoca la desaparición de variedades tradicionales mucho más rusticas que las actuales y una gran vulnerabilidad de las distintas citriculturas que son prácticamente monocultivos. Este riesgo ya lo hemos sufrido en España, donde la aparición de la tristeza acabó con la citricultura basada en el monocultivo del patrón naranjo amargo. Actualmente casi tenemos otro monocultivo basado en el patrón citrange Carrizo, por lo que la hipotética aparición de una nueva enfermedad especifica del mismo provocaría una nueva catástrofe.
El Banco de Germoplasma de Cítricos del IVIA tiene como objetivo disponer de una colección que represente la mayor variabilidad posible de los cítricos cultivados y de las especies silvestres relacionadas, con dos objetivos fundamentales: disponer de variedades sanas de alta calidad que se puedan usar directamente para la propagación comercial y conservar genotipos de la subfamilia de las Aurantiodeas, a la que pertenecen los cítricos, que puedan usarse para la mejora genética del cultivo y otros proyectos de investigación (Figura 8).
En el Banco de Germoplasma de Cítricos del IVIA se incluyen todos los genotipos saneados por microinjerto y actualmente contiene 510 genotipos que representan a 45 especies del género Citrus y a 32 especies de 17 géneros afines a los cítricos.
El número mayor de genotipos corresponde a las tres especies más ampliamente utilizadas en las plantaciones comerciales: naranjos dulces con 122 genotipos, clementinas con 69 genotipos y limoneros con 43 genotipos. El conjunto de otros mandarinos e híbridos tipo mandarino está representado por 102 genotipos. También se incluyen prácticamente con todas las especies con utilidad potencial como patrones. Una lista de los genotipos del banco está en la dirección de internet http://www.ivia.es/biot/germop.htm.
Un objetivo del Banco que se ha cumplido con éxito es la conservación de la gran mayoría de las variedades tradicionales que se cultivaron en España en el pasado. Ello ha sido posible gracias a la colección de variedades existentes en la antigua Estación Naranjera de Burjasot y a prospecciones propias.
El Banco de Germoplasma está compuesto por tres colecciones diferentes:
A) Colección de campo. Se incluyen de dos a seis árboles de cada genotipo injertados generalmente sobre citrange Carrizo y/o mandarino Cleopatra, excepto los limoneros que se injertan en naranjo amargo y/o Citrus macrophylla (Figura 9). En ella se realiza la caracterización de genotipos de acuerdo con los descriptores de IPGRI y de la UPOV (Unión Internacional para la Protección de Nuevas Variedades de Plantas). La caracterización en campo de los genotipos es muy importante para determinar su conformidad y para evitar duplicaciones.
Los datos de caracterización se almacenan en una base de datos desarrollada en el IVIA, denominada GERMO, que permite una eficiente y rápida comparación de genotipos.
Esta colección también se usa como referencia para los estudios relacionados con la protección de variedades que se realizan en el IVIA por encargo de las Oficinas de Variedades Comerciales española y de la Unión Europea. La colección al aire libre tiene el inconveniente de que las plantas se pueden reinfectar fácilmente por patógenos transmisibles por insectos vectores (tristeza, vein enation) y pueden perderse por accidentes meteorológicos o de otra índole.
B) Colección protegida. Es una colección de plantas cultivadas en contenedores en el interior de recintos protegidos por malla antipulgón (Figura 4). Inicialmente se mantenían dos plantas de cada genotipo, pero recientemente se han reducido a una planta por genotipo, debido a necesidades de optimización de espacios y al hecho de que en 30 años no se ha muerto ninguna planta del género Citrus.
La protección con malla protege a las plantas de la reinfección con enfermedades, que nunca se ha producido. Los recintos disponen de un sistema de protección contra heladas por nebulización de agua, que ha sido muy efectivo en heladas severas. Tan solo han muerto cinco plantas de especies silvestres muy sensibles a las bajas temperaturas, debido a que en la helada de este año se alcanzaron temperaturas de ?5 a ?7ºC en la zona de los recintos durante muchas horas en varios días.
La colección protegida se usa como bloque inicial de material para el programa de certificación y para diversos trabajos de investigación.
En consecuencia, las plantas se analizan periódicamente de acuerdo con el Reglamento de Certificación para comprobar su estado sanitario (Figura 1).
C) Colección crioconservada. Está constituida por callos embriogénicos que se mantienen en nitrógeno líquido a ?196ºC (Figura 10), que se usa como conservación a largo plazo y también como fuente de material para la mejora genética usando distintas biotecnologías (DURAN-VILA y col., 2005).
Distribución de material sano
Todos los genotipos del banco están disponibles para los viveros de cítricos, excepto las variedades registradas que están sujetas a diversos acuerdos restrictivos de utilización. La primera distribución de material sano se realizó en 1979 y desde entonces un total de 160 genotipos se han suministrado a los viveros para el establecimiento de árboles de base. Estos genotipos incluyen variedades comerciales y ornamentales y patrones. La selección de variedades para el cultivo varía de acuerdo con la demanda de los consumidores y con frecuencia nuevas variedades mejoradas sustituyen a otras más antiguas. En la actualidad los viveros propagan regularmente más de 40 variedades.
Los viveros iniciaron la venta de plantones certificados procedentes del Programa en 1982. Desde entonces han vendido a los agricultores alrededor de 110 millones de plantones. Teniendo en cuenta que todos lo viveros usan para la propagación exclusivamente material procedente del Programa, muy pronto prácticamente el 100% de la citricultura española estará formada por árboles obtenidos originalmente por la técnica del microinjerto de ápices caulinares.
Inicialmente, había solo 9 viveros que estaban asociados en torno a 2 bloques de árboles de base.
El número de viveros se incrementó en pocos años a 16, pero manteniendo la asociación en torno a los dos bloques de base iniciales. Sin embargo, en los últimos años el número de viveros ha aumentado hasta los 39, que están asociados en 9 bloques de base.
Este incremento brusco se ha podido realizar de forma controlada en cuanto a la utilización de material para la propagación, ya que todos los nuevos viveros han usado exclusivamente material sano del Banco de Germoplasma del IVIA desde el inicio de sus operaciones. Esto ha sido posible en parte debido a la propia colaboración de los viveristas, que colaboran en la financiación del Programa. No obstante, el incremento de actividades de control como consecuencia del aumento del número de viveros requiere igualmente un aumento de las dotaciones presupuestarias y de personal por parte de las distintas administraciones implicadas.
Conclusiones
El Programa de Mejora Sanitaria de Variedades de Cítricos ha producido enormes beneficios socioeconómicos para la citricultura española, entre los que pueden mencionarse los siguientes:
- El cultivo de plantas sanas está produciendo un aumento de la producción estimada entre el 10 y el 25%, que además va acompañado de un incremento de la calidad de los frutos (Figura 11).
- El Programa ha contribuido de forma muy importante a la reestructuración varietal de la citricultura española realizada en los últimos 25 años, debido a la amplia gama de variedades disponibles.
- La utilización de variedades libres de patógenos elimina las restricciones previamente existentes para la utilización de los patrones tolerantes a tristeza.
- Muchas de las enfermedades existentes en el pasado en la citricultura están desapareciendo delas plantaciones, con lo que la investigación puede centrarse exclusivamente en las enfermedades transmisibles por vectores.
- Ha disminuido el riesgo de introducción de enfermedades exóticas con el material de propagación y además, el Programa es una herramienta muy eficaz para controlar la posible aparición de nuevas enfermedades
- En la actualidad España es el único país productor de la Cuenca del Mediterráneo que no tiene su producción amenazada por virus y agentes similares, lo que es un aspecto estratégico de gran importancia para la exportación.
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