Aunque han aparecido nuevas técnicas analíticas para la determinación de las especies fúngicas, una herramienta importante y tradicional para el control micológico es el uso de métodos simples de identificación especifica que se realiza en base al aspecto de las colonias y la micromorfología en varios medios de cultivo a distintas temperaturas de incubación. El objetivo de este estudio fue caracterizar morfológicamente y culturalmente al hongo Fusarium culmorum aislado a partir de muestras de arroz con un periodo de almacenamiento de nueve meses. Para ello, se procedió a utilizar cuatro medios comunes: PDA, MEA, Cz y PSA en los que se sembró la especie en uno y tres puntos respectivamente y se incubó durante 5 días a 25ºC por ser esta la temperatura óptima descrita por varios autores. Para el estudio de las características microscópicas se utilizó la técnica del microcultivo.

INTRODUCCIÓN 

De los genitivos plurales latinos fusus-i (huso, por la forma de las esporas) y culmus-i (caña) Fusarium sp. comprende una gran diversidad de  hongos que están distribuidos por todo el mundo como oportunistas, saprofitos de restos vegetales e importantes patógenos de una gran variedad  de plantas de diversas condiciones medioambientales (DOOHAN y col., 2003; LOGRIECO y col., 2003). 

Las clamidosporas son ovales o globosas, intercalares o terminales con paredes lisas o rugosas, formadas individualmente en cadenas o  en racimos.  Además se caracteriza por secretar una sustancia hidrófila en cultivos viejos de 2 ó 3 semanas y por la germinación de los macroconidios para  producir microconidios aberrantes en fiálides pequeñas.

Los macroconidios constituyen una importante fuente de inoculo y se convierten en  el suelo en clamidosporas donde pueden sobrevivir durante muchos años para posteriormente germinar infectando las raíces de las plantas  (SITTON y col., 1981). 

Es de todas las especies del género Fusarium el único que compite bien con las especies de Aspergillus y Penicillium (LACEY, 1989).  Fusarium culmorum, es considerado como un hongo de campo ya que requiere un alto contenido de humedad en el substrato para su crecimiento  y la síntesis de micotoxinas (> 20 %) pero ocasionalmente se desarrolla en almacén cuando las condiciones le son favorables, es  decir, a bajas temperaturas y alta humedad o si el grano ha sido secado insuficientemente y de forma rápida (LACEY Y MAGAN, 1991; CARUSO y  col., 1999; LOGRIECO y col., 2003; HOPE y col., 2003). 

Con independencia de su origen geográfico sus condiciones óptimas de crecimiento son: una temperatura de 25ºC, una actividad de agua de  0.99 o con un intervalo comprendido entre -8 a -14 bars y un pH bajo. (COOK Y CHRISTEN, 1976; LACEY Y MAGAN, 1991; PARRY y col., 1994; BRENNAN  y col., 2003). Por otra parte es una especie muy tolerante a las bajas tensiones de O2 y presenta una alta resistencia a la radiación (MAGAN  Y LACEY, 1984b; O?NEILL y col., 1991). 

Fusarium culmorum es un importante patógeno de un amplia variedad de plantas, especialmente de cereales, reduciendo la germinación de  las semillas, causando enfermedades en la plántulas, la podredumbre del pie y la raíz y la fusariosis o scab (HESTBERG y col., 2002; MIEDANER  y col., 2004).  La fusariosis fue considerada durante muchos años como una enfermedad de importancia secundaria pero debido a su severidad, el aumento  de su frecuencia de aparición, el impacto que tiene sobre el rendimiento y la calidad del grano y la contaminación de este por micotoxinas,  actualmente es una de las más importantes enfermedades fúngicas (BAI y col., 1996; LIGGITT y col.,1997; DOOHAN y col.,1999; VISCONTI y  col., 2000; YI y col., 2001).

Es una enfermedad compleja y de infección floral llegando a ser asociada con ella hasta 17 especies fúngicas.  Ha sido descrita en todo el mundo siendo F. culmorum predominante en las zonas frías del noroeste de Europa, Canadá y norte de Estados Unidos (PARRY y col., 1995; PIRGOZLIEV y col., 2003; TAN y col., 2003).  Por otra parte, algunos de los agentes de biocontrol descritos para este hongo han sido:  Gliocadium sp., Clonostachis rosea y Phythium sp. (TEPERI y col., 1998; DAVANLOU y col., 1999;  JENSEN y col.,2000).  Fusarium culmorum exhibe una gran diversidad molecular y fenotípica. Agresividad, perfiles  y concentraciones de micotoxinas varían entre aislados (MIEDANER y col., 1996a; GANG y col.,  1998; MUTHOMi y col., 2000). 

La principales micotoxinas que produce son: Zearalenona (ZEA), Deoxinivalenol (DON), Nivalenol  (NIV), Fusarenona-X (FUS), zearalenol (á y á isomeros) (ZoH) y monoacetildeoxinivalenol  (3-AcDON, 15-AcDON) (ac-DON) (LOGRIECO y col., 2003) (Figura 1).  La Zearalenona también llamada toxina F-2, es una lactona derivada del ácido resorcílico. Es un contaminante natural de la mayoría de cereales  como trigo, maíz, cebada, sorgo, etc., ya sea en campo o en almacén. Pero también se ha encontrado en otros alimentos (CHEKOWSKI y  col., 1983; TANAKA y col.,1985; UENO,1985; GONZÁLEz y col., 1999; SILVA y col., 2001). Se caracteriza por ser débilmente fitotóxica y producir hiperestrogenismo  y problemas reproductivos en el ganado y animales de experimentación (DESJARDINS y col., 2001).

El nivel máximo admisible oscila  entre 30 y 1000 ?g/Kg de cereales, legumbres y nueces según los países (SANCHIS y col.,2000).  DON, NIV y FUS son tricotecenos de tipo B que poseen una función carbonilo en el carbono 8. Los tricotecenos son ésteres de alcoholes sesquiterpénicos  que contienen un sistema característico de anillo tricíclico junto con el grupo 12,13-epóxido. DON produce diarrea, nauseas, vómitos,  cefalalgia, dolor abdominal, anorexia, escalofríos, convulsiones, vértigo; y tiene efectos sobre el sistema inmunitario de los humanos, y en  animales produce rechazo del alimento, vómitos e inmunosupresión (TERAO y col., 1991; BULLERMAN, 1997). 

Materiales y métodos 

Aislamiento de la especie 

La especie que se ha utilizado en este trabajo, fue aislada en el laboratorio  de Biología Vegetal de la Escuela Técnica Superior del Medio Rural y Enología  de muestras de granos de arroz con un periodo de almacenamiento de 9 meses. 

La empresa suministradora fue COPSEMAR.  Para ello se preparó Agar Patata Dextrosa al que se añadió clorafenicol a  razón de 0,5 g/l para evitar el crecimiento de levaduras y bacterias.  En una gasa previamente esterilizada se colocaron 50 granos que fueron sumergidos  en una solución de hipoclorito sódico al 2% durante 3 minutos y después se  hicieron dos enjuagues sucesivos de la misma duración con agua destilada estéril. 

Posteriormente, se colocaron asépticamente 5 granos por placa y se incubó  durante 5 días a 25ºC en oscuridad (Figura 2).  Finalmente, se procedió a separar las diferentes colonias de las especies  fúngicas. 

Crecimiento in vitro de la especie 

Se observaron los mohos crecidos en cuatro medios comunes: Agar Patata  Dextrosa (PDA), Agar Extracto de Malta (MEA), Agar Czapek-Dox (Cz) y Agar  de Dextrosa Sabouraud (ADS).  La siembra se hizo en uno y tres puntos equidistantes con placa invertida,  y se incubaron a 25ºC durante cinco días. 

Para la caracterización microscópica y debido a que la manera de formarse  las esporas y las características de la célula conidiógena son fundamentales para  la identificación de los fusarios, fue necesario emplear la técnica del microcultivo  (STEIFERT, 2000). Para ello se depositó un cuadrado de 1 cm de lado de los  distintos medios empleados sobre un portaobjetos. Se sembró el hongo en los  bordes y se colocó el cubreobjetos. El conjunto se apoyó sobre una varilla de  vidrio dentro de una placa Petri en cuyo fondo se había depositado papel de  filtro embebido en agua. Todo el material utilizado fue esterilizado previamente  y el montaje se realizó en condiciones asépticas. 

Determinación de caracteres morfológicos y culturales 

En cada una de las placas se observaron los siguientes caracteres: 

Caracteres morfológicos: 

1. Características de las hifas sumergidas: color, presencia o ausencia de septos,  diámetro aproximado y caracteres distintivos de estructuras especiales  si tienen. 

2. Grado de desarrollo de las estructuras de fructificación. 

3. Características y disposición de los órganos de fructificación maduros, libres  o bien en el substrato, en la superficie o en el micelio aéreo. También  es muy importante destacar si existe más de un tipo de estructura de esporulación.

4. Color, tamaño y forma de los órganos de fructificación, tomando medidas  de las partes esenciales y disposición en ellas de esporas. 

5. Detalles sobre la estructura de fructificación, tomando medidas de las partes  fundamentales y disposición en ellas de las esporas. 

6. Detalles completos de las esporas: color, forma, tamaño, tabicación y marcas  superficiales. 

Caracteres culturales: 

1. Grado de crecimiento. Se describe como muy lento, lento, moderado, discreto,  rápido, etc. En algunas diagnosis se dan los diámetros reales de las  colonias transcurrido un determinado número de días. 

2. Color de la colonia y cambios que pueda sufrir. Si es uniforme, por zonas  o en mosaico. Es interesante anotar también los colores que aparecen alrededor  de las colonias en desarrollo. 

3. Colores y cambios que puedan producirse en el reverso de las colonias. 

4. Cambios de color en el medio, tanto si tienen lugar sólo en el área de la  colonia o si se ha difundido a este. 

5. Textura superficial, ya sea suelta o compacta, plana, rugosa o curvada, aterciopelada,  algodonosa, filamentosa, gelatinosa, etc. 

6. Olor si existe. En general son muy difíciles de describir. Muchas especies  tienen un olor que podríamos catalogar como "enmohecido". 

7. Características del exudado del líquido transpirante, que se encuentra, a veces,  en el crecimiento aéreo  Las principales monografías que se han utilizado para la clasificación del  género Fusarium son: Booth (1977); Gerlach y Niremberg, (1982); Nelson y col.  (1983); Burgess y col. (1988); Pitt y Hocking (1999); Samson y col. (2000). 

Resultados y discusión 

En PDA a 25ºC las colonias presentan un diámetro de 7.5 a 9 cm en 4 días siendo  donde se presenta un mayor crecimiento. El micelio aéreo es algodonoso, al  principio su color va de blanco a amarillo o rosa, volviéndose ocre o marrón rojizo y fieltroso cuando se hace viejo.

El reverso y la superficie del agar, adoptan  una coloración roja-púrpura o marrón (Figura 3).  En ADS el crecimiento es muy similar al que se produce en PDA aunque un  poco menos vigoroso y de una tonalidad más intensa.  Las colonias en MEA presentan un diámetro de 4 a 5 cm, en 4 días, de aspecto  aterciopelado. De color rojo claro hasta rojo pastel, comúnmente con una  capa naranja grisácea hasta marrón amarillenta; reverso marrón a marrón rojizo  (Figura 3). 

Las colonias crecidas en Agar Czapek, alcanzan un diámetro de 5 y 6 cm  a los cuatro días de crecimiento. El micelio aéreo es menos algodonoso que  en PDA, el color del mismo varía desde entre blanco y amarillo, convirtiéndose  con el tiempo en un naranja pálido. El reverso toma una coloración amarillo  intenso o rosa (Figura 3) 

Los macroconidios normalmente tienen 5 septos (aunque podemos encontrar  de 3, 4, 6, 7 y 8 septos); 3 septos: 26-36 x 4-6 ?m; 4 septos: 30-46 x  5-7 ?m; 5 septos: 34-50 x 5-7 ?m. Clamidosporas: 10-14 x9-12?m (Figura 4). 

 

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