Uno de los factores claves en Sanidad Vegetal es la correcta identificación de los patógenos que están asociados a una enfermedad. La gran evolución que ha experimentado la biología molecular en estos últimos decenios ha impactado de forma beneficiosa en el ámbito de la Sanidad Vegetal. La biología molecular permite comparar regiones de los ácidos nucleicos (ADN y ARN) y a partir de este conocimiento se han ido desarrollando técnicas analíticas para todos los grupos de patógenos de plantas.
El Laboratorio del Servicio de Sanidad Vegetal del Departament d?Agricultura, Ramaderia i Pesca de la Generalitat de Catalunya ha incorporado el uso de las técnicas moleculares en sus rutinas de trabajo con el fin de ofrecer soluciones aplicadas a la detección y caracterización de patógenos vegetales. El conocimiento todavía incompleto de la diversidad genética que se observa tanto entre especies como entre poblaciones impide poder ofrecer soluciones a todos los problemas que actualmente se plantean en sanidad vegetal. Por este motivo y con el objeto de contribuir a la mejora del diagnóstico en la Sanidad Vegetal, el Laboratorio de Sanidad Vegetal también promueve y colabora en proyectos destinados a ampliar estos conocimientos y desarrollar nuevos métodos y aplicaciones.
Los métodos moleculares tienen la misma limitación que los serológicos en cuanto no ofrecen información sobre la viabilidad de los patógenos, la mayor estabilidad del ADN respecto a otras biomoléculas permite detectar un organismo por técnicas moleculares aunque sea inviable, inactivo o esté parcialmente descompuesto. A pesar de esta limitación, los métodos moleculares juegan un papel cada vez mayor en diagnóstico, cuarentena o epidemiología.

Taxonomía

Las moléculas de los genes de las subunidades ribosomales rRNA conllevan, en las variaciones de las secuencias que se dan entre las especies, una gran cantidad de historia de la evolución. La información obtenida al secuenciar los genes ribosomales ha confirmado y ampliado nuestro conocimiento sobre la taxonomía de algunos grupos de organismos, a la vez que proporciona un marco estable para cambios de nomenclatura.

Aplicación en la detección y caracterización de organismos

Las diferencias entre secuencias puestas de manifiesto en los estudios de filogenia tienen aplicaciones directas en el diagnóstico. Las secuencias alternadas de regiones invariables, semiconservadas y altamente variables, que componen los genes, permiten el diseño de sondas de oligonucleótidos para hibridación o iniciadores para la PCR.

Los procedimientos generalmente explotan las secuencias de ADN basadas en genes ribosomales que son marcadores neutrales no relacionados con las interacciones planta-microorganismo, no obstante, las secuencias de genes relacionados con la patogenicidad y virulencia también se pueden utilizar para el diagnóstico y la detección de patógenos. En el Laboratorio de Sanidad Vegetal de la Generalitat de Catalunya se realiza, por métodos de biología molecular, la detección de distintos organismos (Tabla 1).

La aplicación de los métodos moleculares para el diagnóstico de patógenos vegetales, no se ha hecho de forma gratuita, sino que responde a criterios de fiabilidad, rapidez o especificidad. Así por ejemplo, en el análisis de Armillaria, nos permite llegar a nivel de especie en pocos días a partir del micelio extraido directamente de la raíz, sin necesidad de cultivar el hongo.

En el caso de Agrobacterium tumefaciens, nos permite detectar la presencia del plásmido inductor de tumores en tejidos vegetales, sin esperar a obtener cultivos puros de la bacteria. Del mismo modo en organismos de cuarentena como Guignardia citricarpa, Monilia fructicola, Xanthomonas axonopodis pv. citri o Acidovorax avenae ssp. citrulli, nos permite detectar la presencia del patógeno en material vegetal procedente de importación o para exportación en un tiempo prudencial, teniendo en cuenta las urgencias comerciales en productos perecederos.

También es una herramienta muy útil para confirmar la presencia de patógenos, ya sea a partir de material vegetal o de cultivos puros, como puede ser el caso de Erwinia amylovora, Clavibacter spp., Ralstonia solanacearum, etc. Otro aspecto interesante de estas técnicas es el hecho de poder determinar diferentes especies de Trichoderma, utilizadas en control biológico, cuya identificación por los métodos clásicos puede ser complicada y requiere de especialistas en el género. La complejidad de la etiología de las necrosis de madera de vid, en la que están implicados diferentes hongos patógenos, ha condicionado que se invierta un notable esfuerzo en la puesta a punto de métodos moleculares de diagnóstico que permitan determinar los diferentes organismos de un modo más práctico, rápido y fiable.

Los trabajos realizados en la caracterización de Colletotrichum spp. en aceituna causante de la antracnosis, han permitido desarrollar métodos de diferenciación de las especies implicadas. En el caso de la determinación de fitoplasmas o viroides, las técnicas moleculares son básicas, ya que no se dispone de técnicas alternativas prácticas y fiables para su diagnóstico.

En el análisis de virus, las técnicas moleculares se complementan generalmente con las serológicas para dar más resolución al diagnóstico, especialmente en los casos en que el título antigénico sea bajo y pueda dar resultados errónemanete negativos con serlogía. En otros casos, a falta de sueros comerciales, se convierten en la técnica óptima para el diagnóstico.

Aplicación a la cuantificación de organismos

Con el método recientemente introducido de la PCR a tiempo real, los productos de PCR se detectan a medida que se van produciendo y acumulando. Esta metodología ofrece algunas ventajas muy interesantes respecto a la PCR convencional, por un lado se evitan las manipulaciones posteriores a la PCR y con ello se evitan los posibles falsos positivos y por otro posibilita la cuantificación del agente que se está detectando.

En el Laboratorio de Sanidad Vegetal de la Generalitat de Catalunya se han desarrollado métodos de PCR a tiempo real para la detección y cuantificación de algunas bacterias y fitoplasmas de cuarentena.