En este trabajo se analiza el efecto de los tratamientos con Brotomax® y de la radiación UV sobre los niveles de flavonas polimetoxiladas en frutos maduros de diferentes variedades de Citrus sinensis, así como sobre la respuesta de dichos frutos frente a los procesos de infección
por Penicillium digitatum.
Los resultados ponen de manifiesto que en "Valencia Late" se detectan los mayores niveles de nobiletina, sinensetina y tangeretina, mientras que en "Navelate" se detectan los mayores niveles de heptametoxiflavona. El estudio "in vitro" revela que estos compuestos actuan como agentes antifúngicos frente a Penicillium digitatum.
Los tratamientos post cosecha a Citrus sinensis (var. "Valencia Late") con Brotomax 0,5%, o con radiación UV-C (254 nm) durante 2 h, producen incrementos de las flavononas polimetoxiladas presentes en dichos frutos entorno al 10 y 50%, respectivamente. Paralelamente, se observa una inhibición del crecimiento "in vivo" de dicho hongo entorno al 20 y 40%, respectivamente, en los frutos así tratados, que podría estar relacionada con una mayor autodefensa en dichos frutos frente a Penicillium digitatum, si se tiene en cuenta los incrementos observados en flavonas polimetoxiladas por efecto de dichos tratamientos.
INTRODUCCIÓN
Una de las principales enfermedades post-cosecha en los frutos cítricos es la causada por Penicillium digitatum (HOLMES Y ECKERT 1995). Para prevenir el desarrollo de este patógeno y reducir las pérdidas comerciales que se producen durante el almacenamiento y transporte de los frutos, se utilizan tratamientos con fungicidas químicos. Sin embargo, tales tratamientos pueden producir serios problemas con los residuos en el fruto (CABRAS y col. 1999) y la aparición de cepas de P. digitatum resistentes al fungicida (BEN-YEHOSHUA y col. 1994). Una estrategia alternativa en la lucha frente a este patógeno sería la alteración de los mecanismos de defensa natural de la planta. En este sentido, aunque escasas existen algunas aportaciones acerca del posible papel que los compuestos fenólicos puedan desempeñar como posibles fitoalexinas en algunas especies de Citrus (BEN-AZIZ 1967; ORTUÑO y col. 1997, 2002; DEL RIO y col. 1998, 2004; ARCAS y col. 2000).
El género Citrus contiene una serie de flavonas polimetoxiladas, las cuales son características de cada especie (GAYDOU y col. 1987; MIZUNO y col. 1991). Estos compuestos se localizan principalmente en la piel de los cítricos, detectándose los mayores niveles durante las etapas juveniles de desarrollo del fruto (DEL RÍO y col. 1998; ORTUÑO y col. 1999), siendo baja o nula su presencia en otros géneros (HOROWITZ 1961).
Entre dichos compuestos cabe mencionar, sinensetina (5,6,7,3?,4?-pentametoxiflavona), tangeretina (5,6,7,8,4?-pentametoxiflavona), quercetogetina (3,5,6,7,3?,4?-hexametoxiflavona), nobiletina (5,6,7,8,3?,4?- hexametoxiflavona), 3,5,6,7,8,3?,4?- heptametoxiflavona, y 7-hidroxi-3,5,6,3?,4?-hexametoxiflavona (OOGHE y col., 1994; DEL RÍO y col, 1998, 2004).
La importancia de las flavonas polimetoxiladas presentes en los cítricos está ligada a su potencial farmacológico, así como a su posible papel fisiológico y posible utilización como marcadores taxonómicos. En este sentido, sinensetina y nobiletina son efectivas disminuyendo la agregación de eritrocitos y la proporción de sedimentación celular en sangre en humanos (ROBBINS, 1976). Tangeretina induce a los leucocitos a inhibir parcialmente el desarrollo de las células HL-60 las cuales están implicadas en leucemia (HIRANO y col., 1995).
Tangeretina, nobiletina y heptamethoxiflavona tienen propiedades citotóxicas hacia las células cancerosas desempeñando alguna función en la circulación sanguínea de los pacientes con enfermedades coronarias (KUPCHAN, y col., 1965; ROBBINS, 1976). Además, heptamethoxyflavona es un cardiotónico el cual posee un efecto inotrópico positivo en el tejido de corazón de ratón (ITOIGAWA, 1994). Además, algunos autores han sugerido que algunos de estos compuestos pueden actuar como mecanismo de defensa de la planta frente a patógenos (BENAZIZ, 1967; WEIDENBÖRNER y col., 1992; DEL RÍO y col., 1998, 2004; ORTUÑO y col, 1997,1999, 2002; ARCAS y col., 2000).
Por otra parte, teniendo en cuenta que las flavonas polimetoxiladas características de Citrus son distintas en las diferentes especies cítricas, pueden ser utilizadas como marcadores taxonómicos. En estudios previos hemos puesto de manifiesto que la expresión de estos compuestos fenólicos puede ser modulada en algunas especies e híbridos cítricos por diversos efectores nutricionales (ORTUÑO y col. 1997; DEL RÍO y col. 2000) y ambientales (ARCAS y col. 2000).
El enriquecimiento de los frutos cítricos en estos compuestos fenólicos puede tener un efecto beneficioso doble para el consumidor, ya que por una parte, el incremento en flavonoides en frutos y zumos cítricos tendrá un efecto directo sobre la salud, y por otra, los frutos cítricos enriquecidos en estos compuestos necesitarán un menor tratamiento post cosecha y por tanto tendrán un menor contenido en pesticidas.
En este trabajo nos proponemos realizar un estudio sobre el efecto del Brotomax? y de la radiación UV sobre la expresión de flavonas polimetoxiladas en frutos de Citrus sinensis y su repercusión en el mecanismo de defensa de dichos frutos frente a Penicillium digitatum.
Material y métodos
Material vegetal. Tratamientos con Brotomax® y radiación UV.
En las diferentes experiencias, se utilizaron frutos maduros de diferentes variedades de Citrus sinensis (L.) Osbeck. Entre las variedades estudiadas cabe mencionar: "Valencia Late" y "Summer Navel" de una plantación comercial localizada en Alhama (Murcia); "Navelate" de una plantación comercial localizada en Aguilas (Murcia); y "Sanguinelli" de una plantación experimental del Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario (IMIDA) en La Alberca (Murcia).
Para llevar a cabo los tratamientos con Brotomax®, los frutos se sumergen en solución acuosa de Brotomax? 0,5% durante 1 hora. Después de desecarse, los frutos se almacenan durante 8 días en una cámara a 15ºC antes de ser utilizados en los diferentes ensayos. Para los tratamientos con radiación UV, los frutos se colocan bajo luz UVC (254 nm) usando una lámpara germicida G30T8 (OSRAM SYLVANIA Products Inc., USA) durante 2 h, a una distancia de 65 cm desde la fuente de UV-C (0,1 W/m2).
Cultivo de hongo, inoculación y evaluación de la resistencia de los frutos.
El hongo Penicillium digitatum fue obtenido de la Colección Española de Cultivos Tipo (Valencia, España) y cultivado en medio PDA (patata dextrosa agar) a 25ºC, siendo éste usado como inóculo en los ensayos posteriores. Para los estudios in vivo de la infección, se eliminan dos secciones de 6 mm de diámetro del flavedo de los frutos, tanto en frutos control como en tratados previamente con Brotomax®, o radiación UV-C, mediante un capilar y un escalpelo estéril. En cada herida se coloca un disco de diámetro similar del medio de cultivo con micelio de Penicillium digitatum.
La inoculación se lleva a cabo inmediatamente después de producir las heridas, y éstas se sellan con cinta adhesiva de plástico. Los frutos se almacenan en una cámara a 20ºC y con un 85% de humedad relativa. A diferentes tiempos desde la inoculación, se determina el crecimiento del hongo en los frutos midiendo el diámetro de la colonia del hongo en mm.
Extracción y determinación cromatográfica de flavonas polimetoxiladas.
Las flavonas polimetoxiladas presentes en los frutos maduros de Citrus sinensis ensayados se extraen y analizan por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), siguiendo el procedimiento descrito en trabajos previos (DEL RÍO y col., 1998).
Estudio de la actividad antifúngica de las flavonas polimetoxiladas.
Para la medidad de la actividad antifúngica de las flavonas polimetoxiladas (nobiletina, sinensetina, heptamethoxyflavona y tangeretina) aisladas de los frutos maduros de C. sinensis, se colocan discos de 5 mm diámetro de medio de cultivo conteniendo micelio de P. digitatum sobre medio de cultivo PDA (control) o sobre medio de cultivo PDA al que se le ha incorporado previamente una concentración conocida de las diferentes flavonas polimetoxiladas descritas anteriormente.
En cada caso, se analiza el crecimiento del hongo midiendo el correspondiente radio del micelio (cm) transcurridos diferentes tiempos desde la inoculación. El efecto de los compuestos fenólicos adicionados en el medio sobre el crecimiento del hongo se estudia utilizando un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM10 (Carl Zeiss, Oberkochen, FRG), siguiendo el procedimiento descrito en trabajos previos (DEL RÍO y col. 2001).
Reactivos.
Brotomax® fue proporcionado por Agrométodos S. A. (Madrid, España). Las flavonas sinensetina y tangeretina fueron suministradas por Extrasynthèse S. A. (Genay, Francia). Heptametoxiflavona y nobiletina fueron obtenidas por cromatografía líquida de alta resolución semipreparativa e identificadas por espectrometría de masas (DEL RÍO y col, 1998).
Resultados y discusión
Niveles de flavonas polimetoxiladas presentes en frutos maduros de Citrus sinensis.
Los análisis cromatográficos de frutos maduros de Citrus sinensis revelan la presencia de las flavonas polimetoxiladas sinensetina, tangeretina, nobiletina y heptametoxiflavona (Figura 1). Nobiletina y sinensetina se detectan en las cuatro variedades estudiadas si bien en diferentes concentraciones (Tabla 1). La mayor concentración de nobiletina y sinensetina se detectan en "Valencia Late" (11 y 5,6 mg/100 g peso seco, respectivamente) seguida de "Navelate" (4,2 y 1,9 mg/100 g peso seco, respectivamente), "Summer Navel" (2,2 y 0,9 mg/100 g peso seco, respectivamente) y "Sanguinelli" (1,1 y 0,7 mg/100 g peso seco, respectivamente).
El mayor nivel de heptamethoxyflavona se detecta en "Navelate" (5,4 mg/100g peso seco) seguida de "Valencia Late" (4,2 mg/100g peso seco). "Summer Navel" contiene aproximadamente 1,3 mg/100g peso seco, mientras que esta polimetoxiflavona no fue detectada en "Sanguinelli". Tangeretina se detectó sólo en "Valencia Late" (1,3 mg/100 g peso seco) (Tabla 1).
Teniendo en cuenta las aplicaciones farmacológicas de estos compuestos fenólicos, la variedad "Valencia Late" es la más interesante para la obtención de las polimetoxiflavonas nobiletina, sinensina y tangeretina, y la variedad "Navelate" para la heptametoxiflavona.
Acción antifúngica de las flavonas polimetoxiladas de Citrus sinensis frente a Penicillium digitatum.
Los estudios realizados in vitro revelan que las flavonas polimetoxiladas aisladas de los frutos maduros de Citrus sinensis, cuando son adicionadas a medio de cultivo PDA, reducen el crecimiento radial de Penicillium digitatum.
Así, en presencia de nobiletina (8 mM) se observa una reducción del crecimiento del hongo en un 75%, transcurridas 100 horas desde que se inició el cultivo, en relación al crecimiento observado en los correspondientes controles. En concordancia con estos resultados, también se ha observado la efectividad de ésta y otras flavonas polimetoxiladas como fungitoxinas frente a otros hongos y en otras especies vegetales (DEL RÍO y col. 1998).
Además de esta inhibición en el crecimiento radial del hongo, también se observan diferentes modificaciones ultraestructurales en las hifas de P. digitatum cuando se cultiva en presencia de nobiletina (8mM) (Figura 2) así como de las otras flavonas polimetoxiladas ensayadas (datos no mostrados). Las paredes celulares de las hifas aparecen más engrosadas después del tratamiento con nobiletina, respecto a los correspondientes controles.
Además, después del tratamiento con nobiletina se observa una menor densidad citoplasmática, grandes vacuolas con un contenido opaco y pequeñas vesículas secretoras bordeando la membrana plasmática, cuando se compara con hifas no tratadas (Figura 2). Estos resultados están en concordancia con los obtenidos por otros autores para diferentes compuestos fenólicos frente a otros hongos patógenos (Rivera- Vargas y col. 1993; Amborabé y col. 2002). Además, una inhibición en la esporulación del hongo fue observada en presencia de nobiletina (datos no mostrados).
Efecto de los tratamientos con Brotomax® y radiación UV sobre los niveles de flavonas polimetoxiladas en frutos de Citrus sinensis y sobre el crecimiento in vivo de Penicillium digitatum.
Los resultados obtenidos al analizar los niveles de flavonas polimetoxiladas en los frutos maduros de Citrus sinensis (var. Valencia Late) tratados con radiación UV-C durante 2 h, revelan un incremento en los niveles de dichos compuestos secundarios entorno al 50%. Similares resultados han sido obtenidos con otras especies cítricas sometidas a similares situaciones de estrés ambiental (ARCAS y col. 2000).
En la Figura 3 se muestran los incrementos (%) en los niveles de flavonas polimetoxiladas en frutos maduros de Citrus sinensis (var. "Valencia Late") por efecto del tratamiento con Brotomax? 0,5%. En ella se observa que todas las flavonas polimetoxiladas estudiadas en este material vegetal, han incrementado, en nuestras condiciones de ensayo, entorno a un 10% por efecto del tratamiento. Similares resultados han sido obtenidos en diferentes materiales vegetales por efecto del tratamiento con Brotomax?, en los que se ha puesto de manifiesto la estimulación de la expresión de otros compuestos fenólicos tales como flavanonas (FUSTER y col., 1994, 1995; BOTÍA y col., 1995) y la cumarina escoparona (BOTÍA y col., 1997; ORTUÑO y col., 1997).
Por otra parte, cuando se analiza la respuesta de los frutos de Citrus sinensis tratados con radiación UV-C (2h) o con Brotomax? 0,5%, frente a la infección por Penicillium digitatum se observa que el crecimiento del hongo en los frutos tratados es inhibido alrededor de un 40 y 20%, respectivamente, con respecto a frutos control, cuando han transcurrido 2, 3, 4 y 5 días desde la inoculación (Figura 4), si se compara con los resultados obtenidos para los controles.
Estos resultados revelan que los tratamientos con radiación UV-C o con Brotomax? (0,5%) confiere a los frutos una mayor resistencia frente a este hongo, probablemente debido al aumento en la concentración de flavonas polimetoxiladas descrito anteriormente, ya que como hemos puesto de manifiesto en estudios previos, estos compuestos secundarios pueden actuar como agentes fungistáticos frente a hongos fitopatógenos como Phytophthora citrophthora, Penicillium digitatum y Geotrichum sp. (DEL RÍO y col., 1998).
En base a lo expuesto anteriormente, se sugiere que una posible alternativa al uso de fungicidas químicos podría ser la estimulación de los mecanismos de defensa en el fruto. Estimulando la biosíntesis de los metabolitos secundarios, tales como los compuestos fenólicos, entre otros, bien por tratamiento pre-cosecha (aplicación de Brotomax®) o post-cosecha (radiación UV, aplicación de Brotomax?).
Agradecimientos: Este trabajo ha sido subvencionado por el Proyecto AGR/7/FS/03 de la Consejería de Agricultura, Agua y Medio Ambiente de Murcia, España, y por Agrométodos S.A. de Madrid, España.
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