A lo largo de la historia el hombre ha seleccionado de forma más o menos planificada los recursos fitogenéticos que proporcionaban la cosecha más abundante y de mayor calidad. El término recurso fitogenético comprende todas las combinaciones de genes resultantes de la evolución de una especie vegetal, e involucra todo material (germoplasma) que tiene o puede tener valor económico, científico o social (IBPGR, 1991). La selección se ha dirigido tanto a las características productivas intrínsecas como a las relacionadas con la capacidad de adaptación al medio, es decir, con la capacidad de supervivencia frente a plagas, enfermedades y otras condiciones ambientales adversas. La base para esa selección ha residido en la biodiversidad del germoplasma disponible. Hasta hace poco tiempo esa base se podía considerar suficientemente amplia, pero en las últimas décadas hemos asistido a una preocupante pérdida de biodiversidad. La destrucción de espacios naturales, y la sustitución de la gran diversidad de variedades locales por un reducido número de genotipos son los dos de los principales factores responsables.
La conservación de recursos fitogenéticos se puede abordar mediante dos tipos de estrategias no excluyentes. La conservación in situ es teóricamente la estrategia ideal ya que permite la continuidad del proceso evolutivo. El principal problema al que se enfrenta está relacionado con la pérdida de hábitats naturales y con el abandono de las prácticas agrícolas tradicionales. La conservación exsitu es muy utilizada bien como refuerzo de la conservación in situ, bien cuando ésta no puede llevarse a cabo. Se puede abordar mediante colecciones de semillas mantenidas en condiciones adecuadas de humedad y temperatura (bancosde semillas), mediante colecciones de distintos tipos de explantos mantenidos in vitro, o mediante colecciones de plantas adultas mantenidas en campo.
Las estrategias de conservación ex situ son en la práctica más fáciles de abordar, sin embargo presentan algunos inconvenientes. Por una parte, el proceso evolutivo está casi completamente detenido, por otra se trata de un tipo de conservación que, en mayor o menor medida, desencadena procesos de deriva genética. El caso de la conservación mediante cultivo in vitro es peculiar ya que suele ir asociado a la aparición de mutaciones somáticas (variación somaclonal).
Esta variación puede verse según los casos como un inconveniente o como una ventaja, inconveniente cuando lo fundamental es mantener la integridad genética de los materiales a conservar, ventaja si la variación somaclonal es vista como elemento generador de biodiversidad (KARP et al., 1997; FAO, 1993). El Departamento de Biología de la Universidad Politécnica de Madrid (UPM), a través de su Banco de Semillas, ha sido pionero en la conservación de especies silvestres. Fundado en 1966 por el profesor César Gómez Campo, alberga hoy una de las colecciones de crucíferas silvestres más completa del mundo (http://www.etsia.upm.es/DEPARTAMENTOS/biologia/documentos/GC-2000-Int.htm). Entre otras muchas aplicaciones, su material ha sido base para la caracterización de resistencias en crucíferas silvestres (MITHEN Y LEWIS, 1988; TEWARI y col., 1996). También han sido notables las aportaciones del Departamento de Biología en el desarrollo de técnicas de cultivo in vitro para la conservación de especies vegetales amenazadas. (MARTÍN y col., 1998)
Marcadores específicos para genes de resistencia
Con el fin de facilitar la gestión de los recursos fitogenéticos es necesario proceder previamente a su caracterización (TORRES Y MORENO, 2001). La caracterización primaria implica la descripción morfológica y agronómica del material conservado. El análisis de estos caracteres no siempre es fácil, particularmenteen los casos en los que la interacción genotipo-ambiente actúa como elemento de distorsión. Parte de la variación genética potencialmente interesante puede pasar desapercibida a este tipo de caracterización. Este es el caso, por ejemplo, de la resistencia a ciertas plagas y enfermedades de las plantas en las que la evaluación del fenotipo resistente es difícil y costosa. (KARP et al., 1997).
La caracterización de los recursos fitogenéticos también se puede abordar mediante la utilización de marcadores moleculares neutros o inespecíficos (RAPDs, AFLPs, ISSR-PCR, minisatélites, etc). Se han utilizado para cuantificar, en términos generales, diversidad y distancias genéticas (SUNNUCKS P, 2000; RAFALSKIAND TINGEY, 1993). Presentan dos ventajas importantes, por un lado, no se ven afectados por la interacción genotipo-ambiente y por otro su desarrollo y evaluación no requiere un conocimiento previo del genoma de las especies a caracterizar; esto los hace especialmente adecuados para el estudio de germoplasma silvestre. No obstante, este tipo de marcadores apenas se han utilizado para caracterizar aspectos específicos en germoplasma silvestre, como por ejemplo resistencia a plagas y enfermedades.
El desarrollo de la última generación de marcadores moleculares, los marcadores funcionales o específicos, ha sido posible gracias a la información generadapor los proyectos de genómica en las principales especies cultivadas.
Esta información ha permitido el descubrimiento de motivos conservados en genes que desempeñan el mismo tipo de función en especies diferentes. Así se han abierto nuevas puertas para el estudio de aspectos específicos de plantas silvestres o de cultivos marginales utilizando la información generada por las plantas modelo o las especies cultivadas que hasta ahora han acaparado la mayor parte de los recursos de investigación. Los marcadores funcionales se están utilizando tanto en la caracterización de los recursos fitogenéticos base de los programas de mejora, como en los propios programas de mejora. Así, han sido desarrollados marcadores funcionales, directos e indirectos, para tamaño de planta, tiempo de floración, tamaño de fruto y resistencia a enfermedades (ANDERSENAND LÜBBERSTEDT, 2003; VAN TIENDEREN, et al., 2002). En el Departamento de Biología de la UPM estamos desarrollando marcadores específicos que permitan evaluar regiones relacionadas con genes de resistencia. Se han planteado dos objetivos: (1) la evaluación de germoplasma silvestre de la especie Brassicaoleracea como fuente de genes de resistencia para distintas especies cultivadas del género Brassica (coles, repollos, grelos, etc); (2) el estudio de la variación somaclonal en crisantemo (Dendrathema grandiflorum) como elemento generador de variabilidad en regiones potencialmente relacionadas con genes de resistencia.
Genes de resistencia y transposones
Según un modelo ampliamente aceptado, las proteínas de resistencia, derivadas de los genes de resistencia, actúan en las plantas como guardianes. Para que se desencadene la respuesta defensiva es necesario que la planta, por medio de alguna de sus proteínas guardianas, detecte la presencia del patógeno.
La detección se produce por la interacción directa o indirecta de una determinada proteína de resistencia con una determinada molécula (elicitor) emitida por el patógeno. Cuando esa interacción es de tipo incompatible se desencadena una cascada de señales que conduce a la expresión de los genes de defensa (HAMMOND-KOSACK Y JONES, 1996). La mayoría de las PR actualmente descritas en plantas, presentan la estructura NBS-LRR. El dominio LRR (leucine-rich repeat) está implicado en la interacción con las moléculas elicitoras, asumiendo así un papel muy importante en el reconocimiento del patógeno. Ese dominio está poco conservado, debido probablemente a la necesidad de interactuar con diferentes elicitores. El domino NBS (nucleotide binding site) parece ser el primer transmisor de señales en la cascada que desencadena la respuesta defensiva.
Contiene motivos conservados cuando se comparan genes de resistencia de distintas especies vegetales o genes que confieren resistencia frente a distintos tipos de parásitos. Esos motivos conservados han sido utilizados para aislar análogos o candidatos a genes de resistencia (RGA) en diversas especies (SPEULMAN et al., 1998; LEISTER et al., 1996). El análisis de la secuencia completa del genoma de algunas especies vegetales, como arroz y Arabidopsis ha puesto en evidencia que la mayoría de los genes NBS-LRR se encuentran agrupados en tándem, disposición que podría estar relacionada con la generación de nuevas especificidades. Estas nuevas especificidades podrían desarrollarse por recombinación, conversión génica o por inserción de elementos móviles entre los diferentes genes agrupados (RITCHTER AND RONALD, 2000; MEYERS et al., 2003; CASACUBERTA Y SANTIAGO, 2003)
Los transposones o elementos móviles son fragmentos de DNA con capacidad de cambiar de posición o de expandirse en el genoma diseminando copias en distintos puntos. La actividad de los elementos móviles está regulada enzimáticamente y responde a factores ambientales de forma no bien conocida.
Están ampliamente distribuidos en el reino vegetal y con frecuencia representan una fracción muy significativa del contenido del genoma nuclear (KUMARAND BENNETZEN, 1999). Se pueden clasificar en dos grandes clases en función de su estructura y forma de transposición. Cada clase se suele subdividir en superfamilias en razón de la estructura, pero sobre todo por la presencia de secuencias consenso características. Una superfamilia puede contener miembros en especies muy distintas. A su vez las superfamilias se subdividen en familias que incluyen elementos con un mayor grado de afinidad en su secuencia.
Algunas familias se localizan preferentemente en regiones del genoma desprovistas de genes, otras tienden a situarse en zonas ricas en genes, ciertas familias están representadas por pocas unidades en cada genomio, mientras que otras contienen cientos e incluso miles de copias. Se sospecha que ciertos elementos móviles podrían estar involucrados en la expresión de genes de resistencia y también en la generación de nuevas especificidades (HENK et al., 1999; LESCOT et al., 2004). De lo que no hay duda es que los elementos móviles constituyen una de las principales fuentes de variación somaclonal. Esto parece responder al mecanismo general de activación de elementos móviles bajo situaciones de estrés (WESSLER, 1996).
Recientemente hemos planteado una estrategia que utiliza familias de elementos móviles de alto número de copias e inserción preferencial en zonas de genes, para el acercamiento a regiones relacionadas con genes de resistencia.
Esta estrategia, que se describe en la Figura 1, se está evaluando en el marco de dos proyectos de investigación con distintos objetivos.
Proyecto 1: Conservación de los recursos genéticos silvestres del género Brassica (especies n=9) de la Península Ibérica (RF01-016, IP Itziar Aguinagalde).
En el marco de este proyecto estamos desarrollando marcadores moleculares funcionales que permitan la evaluación de poblaciones silvestres de Brassicaoleracea como fuente de genes de resistencia para su transferencia a las coles y otras hortícolas del género. Se pretende caracterizar cualitativa y cuantitativamente la diversidad genética en esas regiones. También estamos interesados en investigar la influencia sobre esa diversidad del ambiente en el que una determinada población está asentada. El estudio se está realizando sobre germo plasma procedente de cuatro poblaciones naturales de Brassica oleracea procedentes del litoral cantábrico. La colecta de material se realizó durante el verano de 2002 según se describe en Gómez-Campo et al. (2005). Esas cuatro poblaciones se escogieron por estar asociadas a condiciones ambientales lo más distintas posibles en relación con la incidencia de patógenos. La obtención de datos ambientales y su tratamiento informático se está haciendo en colaboración con Mauricio Parra. La estrategia de PCR es la descrita en la Figura 1.
Para el diseño de los tres tipos de cebadores descritos en esa figura, se alinearon secuencias procedentes del género Brassica y también de Arabidopsis thaliana.
Al ser una especie alógama se ha considerado suficiente estudiar 11 individuos de cada población. Cada individuo se analiza por PCR dos veces: una combinando un cebador NP o NH (diseñados a partir de zonas conservadas en un NBS) con un cebador M (idem en un elemento móvil) y otra con solo el cebador M. Sólo se analizan los productos de amplificación que, una vez visualizados en una electroforesis de agarosa, aparecen en la primera PCR pero no en la segunda. Los productos que aparecen en ambas PCRs no interesan ya que probablemente se hayan originado por intervención exclusiva del cebador M y por tanto no es de esperar que tengan relación alguna con regiones que contengan candidatos a genes de resistencia.
Proyecto 2: Variación somaclonal en especies hortícolas: papel de los patrones de metilación y posibles repercusiones en genes de resistencia (AGL2004-01929, IP César Pérez-Ruiz)
Uno de los objetivos de este proyecto consiste en caracterizar sobre líneas de cultivo in vitro de crisantemo, la variación somaclonal en regiones del genoma relacionadas con genes de resistencia. El acercamiento a dichas regiones ha podido realizarse a pesar de que en las bases de datos públicas no existe actualmente ni una sola secuencia de crisantemo relacionada con genes de resistencia.
Esta carencia se ha suplido mediante el análisis comparativo de ese tipo de secuencias en especies dicotiledóneas pertenecientes a distintas familias. La estrategia de PCR es la misma descrita para el primer proyecto y esquematizada en la Figura 1. La única diferencia es que en este caso también se han utilizado cebadores de tipo M en solitario. Dado que se está estudiando la variación derivada de cultivo in vitro, es de esperar que en su mayoría estos polimorfismos sean atribuibles a eventos de inserción/deleción de elementos móviles, ya que la transposición de éstos ha sido descrita como una de las principales causas de variación asociada al estrés. Se han analizado cuatro líneas de crisantemo de la variedad "Red Focus", dos de "Red Reagan" y una de "Paso Doble".
Cada línea constituida por aproximadamente nueve generaciones de cultivo in vitro. El proceso se inició con la extracción y cultivo de meristemos, y las sucesivas generaciones se fueron obteniendo mediante el cultivo de ápices caulinares.
El material de cultivo in vitro ha sido obtenido por Mª Carmen Martín Fernández y Soledad Miñano. El estudio de este material ha proporcionado un total de 8 bandas polimórficas. Se considera que una banda es polimórfica si no está presente en todas las generaciones de una determinada línea. En la Figura 2 se muestra una de estas bandas polimórficas en una de las líneas de la variedad "Red Reagan". En este momento se están secuenciando esas bandas, lo que se espera permita acotar la influencia de los elementos móviles en la variabilidad alélica de los candidatos a genes de resistencia y en la aparición de nuevas especificidades.
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