Según datos del ISAAA (International Service for Acquisition of Agrobiotechnological Applications) en el año 2004 el cultivo de plantas transgénicas ha alcanzado a nivel mundial una extensión de 81 millones de hectáreas distribuida en 17 países distintos. Estudiando la evolución de esta cifra en los últimos diez años, las previsiones para el 2010 son de 160 millones de hectáreas de cultivos biotecnológicos en 30 países y 15 millones de agricultores utilizando esta tecnología. Estos datos indican que la ingeniería genética vegetal, está siendo universalmente aceptada y que las reticencias que se perciben en Europa frente a ella no parecen ser compartidas en otros países tanto desarrollados como en vías de desarrollo.
Genética y mejora de plantas
Cuando el hombre se hizo agricultor, hace unos 10.000 años, empezó a hacer genética sin saberlo. La domesticación de las plantas "seleccionó contra natura" ciertos caracteres, cada uno de ellos dependiente de uno o pocos genes: raquis tenaz frente a raquis frágil; germinación uniforme de las semillas; porte erecto frente a porte rastrero; frutos y semillas grandes y sin compuestos tóxicos, etc. De este modo, las especies domesticadas perdieron su capacidad de vivir en la naturaleza sin el concurso del hombre. Los mismos procedimientos que posibilitaron la domesticación sirvieron para introducir cambios adicionales en el genoma vegetal que mejoraron la aptitud para el cultivo y la adaptación de la especie doméstica a nuevos hábitats. Esto último fue particularmente relevante cuando las plantas del nuevo mundo (maíz, patata, tomate, pimiento, etc.) empezaron a cultivarse en Europa entre los siglos XVI y XVIII. Este último siglo vio además la creación de las primeras empresas de semillas, como la Vilmorin en Francia. De este modo, durante varios siglos generando variabilidad (por hibridación) y seleccionando entre las nuevas combinaciones génicas aquéllas que posean mejores propiedades agronómicas, se han logrado las variedades vegetales de alto rendimiento que cultivamos en la actualidad.
Los avances científicos de finales del siglo XIX y principios del XX que llevaron el descubrimiento de las leyes que rigen la segregación de caracteres en la descendencia de los híbridos, la teoría de la evolución, la identificación de los cromosomas como sedes de la información genética, etc. tardaron mucho tiempo en influenciar las técnicas de la mejora vegetal pero finalmente fueron plenamente adoptados en la segunda mitad del siglo XX. La mejora genética vegetal clásica alcanzó su máximo exponente en la llamada "Revolución Verde" liderada por Norman Borlaug, quien desde el Centro Internacional para el Mejoramiento del Maíz y del Trigo (CIMMYT) en Méjico, logró aumentar el índice de cosecha en trigo al introducir las variedades semienanas que hoy vemos en los campos. La mejora equivalente en arroz se realizó en otro centro internacional (IRRI, Filipinas), siendo las variedades de alto rendimiento en este cereal, de ciclo corto lo que posibilita la obtención de dos cosechas por año, además de poseer una talla semienana y una floración independiente de la duración del día; también se han introducido en ellas genes que proporcionan mayor resistencia a plagas y enfermedades.
La Ingeniería Genética complementa la mejora clásica de plantas
Los grandes avances básicos en el conocimiento del material genético (DNA) de los seres vivos desde que Watson y Crick establecieron la estructura en doble hélice del mismo en 1953, sentaron las bases de la ingeniería genética que hoy se utiliza extensamente para producir sustancias de interés farmacológico en bacterias, tales como la insulina, la hormona de crecimiento, ciertas vacunas, etc. y para producir plantas transgénicas. Las operaciones básicas de esta biotecnología consisten en cortar un fragmento de DNA apropiado y reinsertarlo (unirlo) en otro DNA distinto.
Las técnicas del DNA recombinante están contribuyendo no sólo a la elucidación de los mecanismos fisiológicos básicos de las plantas a nivel molecular sino también a aumentar la variabilidad disponible para la mejora genética, ya que esta metodología permite aislar un gen de cualquier origen (vegetal, animal, bacteriano o incluso sintético) e integrarlo en la planta que interese.
La herramienta básica del mejorador de plantas, la hibridación sexual, puede ser ahora complementada con la transferencia de pequeños fragmentos de DNA conteniendo uno o varios genes, sin requerir de retrocruzamientos largos y costosos. Para lograrlo, se necesitan además de la caracterización molecular de los genes a introducir, vectores adecuados y métodos eficientes para transformar, seleccionar las células vegetales transformadas y regenerar plantas completas a partir de ellas.
El principal objetivo de la transgénesis vegetal sería, por tanto, insertar establemente un DNA concreto en el genoma de una célula vegetal capaz de dar lugar a una planta transformada completa. Transformación sin regeneración o regeneración sin transformación estable no servirían nuestros propósitos.
Método de trangénesis vegetal basado en el plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens
Se sabía desde principios del siglo XX que la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens era el agente causante de la enfermedad de las plantas denominada "agalla de la corona (Crown Gall)". Hacia 1970 se logró demostrar que la bacteriaintroducía un trozo de su propio DNA que se integraba en un cromosomade la planta donde estos genes se expresaban y producían un crecimiento descontroladode las células vegetales afectadas. Es decir, la bacteria hacia ingenieríagenética de un modo natural, transfiriendo a la planta un fragmento desu ADN (el llamado T-DNA) situado entre los bordes izquierdo y derecho delplásmido Ti (LB, RB; Figura 1). En la naturaleza, Agrobacterium infecta a la mayoríade las plantas dicotiledóneas, a algunas monocotiledóneas y a gimnospermas,produciendo los tumores característicos formados por masas desdiferenciadasde células, resultado de la transferencia e integración en el genomade la planta del pequeño fragmento del T-DNA. La caracterización molecularde estos plásmidos, el proceso de transferencia y las causas de la sintomatologíaque producen han sido estudiados con gran detalle (revisiones: DRAPER YSCOTT, 1991; ZUPAN et al., 2000). Estos plásmidos presentan dos regiones esencialespara la movilización e integración del T-DNA en las células vegetales, unacorresponde a ambos extremos del T-DNA (LB y RB) que consisten en una repeticióndirecta casi perfecta de 25 pb (5?TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC3?)y la otra es la llamada región Vir (virulencia) que se requiere para que la excisión,transferencia e integración del T-DNA sean efectivas (Figura 1a).
En las cepas salvajes de A. tumefaciens que causan la enfermedad del "crown gall", el crecimiento tumoral es debido a la expresión de al menos tres genesque dirigen la síntesis de fitohormonas auxinas y citoquininas (Figura 1b). Estasagallas separadas de la planta huésped continúan creciendo axénicamente,sin necesidad de añadir hormonas al medio del cultivo in vitro, en presenciade carbenicilina que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin dañar a lascélulas vegetales. En el T-DNA, que se integra en el genoma de la planta receptora,también se encuentran genes para biosíntesis de opinas (nopalina, octopina,etc.). Las opinas son derivados de aminoácidos que sólo la cepa concretade A. tumefaciens que donó el T-DNA puede utilizar como fuente de C y de N, debido a que el plásmido original, fuera de su T-DNA, tiene genes que permiten el catabolismo de las opinas (Figura 1a). Esto representa una clara ventaja selectiva para el Agrobacterium sobre otras bacterias del suelo, y al aumentar la densidad bacteriana, las opinas estimulan a su vez la conjugación del plásmido Ti ("Quorum sensing" para la regulación transcripcional de la conjugación; FUQUA Y WINANS, 1994).
Mutaciones en la región Vir (35-40 kb) suelen abolir la formación de tumores ya que impiden la transferencia del T-DNA desde el plásmido bacteriano al cromosoma vegetal. Esta transferencia genética entre reinos de la naturaleza se realiza normalmente al azar y en un número variable de copias (1-3 generalmente).
Cuando se separan en dos plásmidos distintos, el T-DNA con sus bordes derecho (RB) e izquierdo (LB), y la región de virulencia, las cepas conservan todas sus propiedades, lo que indica que los genes de virulencia pueden actuar en trans. Esta región Vir está organizada en seis operones (vir A, B, D, G, C y E). El vir A, un locus constitutivo, codifica una proteína de la membrana interna de Agrobacterium, que es un quimioreceptor de acetosiringona.
Este compuesto orgánico es excretado al medio por las células vegetales heridas y al unirse a la proteína codificada por Vir A, produce su activación y fosforila al producto del Vir G que así activa la transcripción de los otros genes Vir.
Un suceso temprano en el proceso de transferencia del T-DNA es la formación de una mella en su sitio concreto del borde derecho (entre la 3ª y la 4ª base del cordón inferior), iniciándose así la liberación de ADN monocatenario en dirección 5??3? hacia el borde izquierdo, en un proceso similar al de la conjugación bacteriana. El operón vir D codifica una endonucleasa que produce las mellas en las secuencias bordes. El vir E codifica una proteína con afinidad por ADN de hebra sencilla que podría estabilizar y proteger el T-DNA en su transporte al núcleo vegetal.
Además de los genes del plásmido Ti, existen varios genes en el cromosoma de Agrobacterium que afectan a la virulencia, relacionados con síntesis de proteínas de pared, de glucanos, de fibrillas de celulosa, etc., que pudieran tener un papel más general en interacciones bacteria-planta. Este tipo de genes también se encuentra en otras bacterias del suelo.
Hoy en día, la estrategia más empleada, para transferir genes de Agrobacterium a plantas, es la conocida, como "estrategia de vectores binarios" que aprovechael hecho de que las funciones de la región Vir pueden actuar en "trans" respecto al T-DNA, permitiendo que éstas puedan ir en un plásmido distinto alque contiene, entre las secuencias de los extremos LB y RB del T-DNA, los genesque se desean introducir en la planta receptora (Figura 1b). De este modo,los genes foráneos se pueden introducir e integrar en la planta mediante cocultivode la bacteria con fragmentos de hoja u otros tejidos. Posteriormente,los genes marcadores ayudarán al reconocimiento y selección de las célulastransformadas durante el proceso de regeneración hasta planta completa.
Métodos directos de transformación
Son métodos físicos capaces de transferir DNA a cualquier célula o tejido vegetal con el único requerimiento de proteger al vector de degradación mecánica o ataque de nucleasas. Unos están limitados al uso de protoplastos y otros se han adaptado para transformar células que se encuentran formando un tejido.
El método más utilizado es el biolístico (Pistola de genes), procedimiento diseñado para transformar células completas que forman parte de un órgano o tejido (Figura 2a-e). Las células se bombardean utilizando microproyectiles de oro o tungsteno (1-3 mm) recubiertos de DNA, acelerados mediante descargas eléctricas, expansión de gases inertes a alta presión (helio), o aire comprimido.
El bombardeo de micropartículas se realiza sobre órganos o tejidos jóvenes capaces de regenerar in vitro una planta completa. Con esta tecnología se han transformado especies recalcitrantes a la agrotransformación como los cereales y diversas leñosas (VASIL, 1994; PETRI Y BURGOS, 2005).
Ejemplo de una aplicación práctica de la Transgénesis Vegetal: plantas resistentes a plagas mediante expresión de proteínas insecticidas
La primera proteína que se expresó transgénicamente en plantas con objeto de hacerlas más resistentes al ataque de insectos fitófagos fue el producto (ä-endotoxina) de un gen Cry de Bacillus thuringiensis (Bt). Antes del desarrollo de la tecnología del DNA recombinante, esta toxina había sido autorizada para usos agrícolas y la empresa SANDOZ había obtenido una patente en 1957 (THURICIDE).
Sin embargo, su utilización no estaba demasiado extendida, dado su elevado precio, su baja persistencia debido a su solubilidad en agua y su fácil degradación.
Hoy en día existen más de 90 variantes de genes Cry caracterizadas, con un amplio espectro de actividad tóxica específica frente a lepidópteros, coleópteros, dípteros y nemátodos y un elevado número de especies vegetales que han sido transformadas, expresando establemente alguna de estas variantes génicas (MAAGD et al., 2001).
La posibilidad de hacer que las plantas expresen su propio insecticida tiene las ventajas siguientes:
- Confinamiento del insecticida dentro de la planta.
- Protección dónde y cuándo se necesita, variando el promotor empleado.
- Ausencia de lavado por lluvias o por agua de riego.
- Efecto sobre los insectos que se alimenten de la planta sin afectar a los demás insectos, por ejemplo, los polinizadores.
- Mejor para el medio ambiente.
- Aumento de la variabilidad potencialmente disponible, al poder expresar transgénicamente proteínas insecticidas de las más diversas procedencias.
En 1987 las empresas Plant Genetic Systems (Bélgica) y Monsanto (USA) patentaron el uso transgénico de la proteína Bt, en tabaco y tomate respectivamente, bajo promotores inducibles por herida y constitutivos. Actualmente el número de compañías que realizan investigación y desarrollo, y que comercializan semillas expresando la proteína Bt es numerosa. Un ejemplo son los maíces Bt, resistentes al taladro, que se cultivaron en 15 millones de Ha en el 2004 (ISAA), de las cuales 60.000 Ha se sembraron en España.
Además de las proteínas Bt, se han caracterizado otras proteínas insecticidas de origen vegetal que posiblemente forman parte del mecanismo natural de defensa. Estas podrían usarse transgénicamente junto con Bt para potenciar sinergísticamente la resistencia de las plantas cultivadas frente a plagas, además de poseer alguna de ellas propiedades fungicidas. Entre otros se han estudiado:
- Inhibidores de serín- y cisteín-proteasas digestivas para controlar larvas de lepidópteros, coleópteros y nemátodos (ALTPETER et al., 1999; CARBONERO etal., 1999; ALFONSO-RUBI et al., 2003; ATKINSON et al., 2003; MARTÍNEZ et al., 2003).
- Inhibidores de á-amilasas contra plagas de almacén (MORTON et al., 2000).
También se están investigando genes que codifican enzimas de la biosíntesis de metabolitos secundarios que transforman ciertos precursores menos activos o inactivos en productos insecticidas, además de los que codifican lectinas, lipoxigenasas, quitinasas y polifenoloxidasas.
Tolerancia a herbicidas y genes marcadores seleccionables
Los vectores utilizados para la transformación de plantas deben llevar genes "marcadores" que permitan seleccionar (genes seleccionables) y/o reconocer las células transformadas (genes delatores o chivatos). Estos genes, dominantes y generalmente de origen microbiano, se ponen bajo el control de promotores eucarióticos fuertes que sean funcionales en las plantas. Cuando el gen de interés agronómico es uno que confiere resistencia a herbicidas, es también un gen seleccionable (Tabla 1). Estos codifican proteínas cuya actividad enzimática permite el crecimiento celular en presencia de herbicidas, bien porque destoxifican al agente selectivo (FosfinotricinaR) o porque codifican enzimas que manteniendo sus propiedades catalíticas, no interaccionan con el herbicida (GlifosatoR).
La soja tolerante a glifosato ocupaba en el 2004 casi 50 millones de Ha, el 60% del total cultivado a escala mundial (ISAAA).
Los genes marcadores delatores, bien codifican proteínas cuya actividad enzimática se puede detectar fácilmente utilizando los sustratos adecuados, o bien producen proteínas autofluorescentes. Los más utilizados codifican los enzimasâ-glucuronidasa (GUS; JEFFERSON, 1987; Figura 2g-i), luciferasa (LUX; KONCZ etal., 1990), y la denominada proteína fluorescente verde de la que existen múltiples variantes (GFP; EHRHARDT, 2003). Los genes delatores son de gran utilidad en el estudio funcional de promotores, bien mediante transformación estable (DÍAZet al., 1995) o mediante expresión transitoria, que permite evaluarlos a las 24-48 horas después de la transferencia del DNA (DÍAZ et al., 2003; 2005).
Reconocimientos: Los trabajos de investigación en nuestro grupo están financiados por BMC03-6345; GEN01-4890-C07-3; GEN03-20209-C02-02; MCYT-AGL2003-00335; MEC-GEN03-208559-C3-2/INT.
BIBLIOGRAFÍA
ALFONSO-RUBÍ J., ORTEGO F., CASTAÑERA P., CARBONERO P., DÍAZ I. (2003) Transgenic expresión of trypsin inhibitor CMe from barley in indica and japonica rice, confers resistance to the rice weevil Sitophilus oryzae. Transgenic Res. 12, 23-31.
ALTPETER F., DÍAZ I., MCAUSLANE H., GADDOUR K., CARBONERO P., VASIL I.K. (1999) Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor CMe. Mol. Breed. 5, 53-63.
ATKINSON H.J., URWIN P.E., MCPHERSON M.J. (2003) Engineering plants for nematode resistance. Ann. Rev. Phytopathol. 41, 615-639
CARBONERO P., DÍAZ I., VICENTE-CARBAJOSA J., ALFONSO-RUBI J., GADDOUR K., LARA P. (1999) Cereal a-amylase/trypsin inhibitors and transgenic insect resistance. In: Genetics and Breeding for Crop Quality and Resistance. (Scarascia-Mugnozza, G.T., Pagnotta, M.A., eds.). Kluwer Academic Publ., pp. 147-158.
DRAPER J., SCOTT R. (1991) Gene transfer to plants. In: Plant Genetic Engineering. Plant Biotechnology Series. Vol. I (Grierson, D., ed.). Blackie/Chapman and Hall, pp. 38-81.
DÍAZ I., MARTÍNEZ M., RUBIO-SOMOZA I., CARBONERO P. (2005) The DOF protein, SAD, interacts with GAMYB in plant nuclei and activates transcription of endosperm-specific genes during barley seed development. Plant J doi:10.1111/j.1365-313X.2005.024202.x.
DÍAZ I., ROYO J, O?CONNOR A., CARBONERO P. (1995) The promoter of the gene Itr1 from barley confers a different tissue specificity in transgenic tobacco. Mol. Gen. Genet. 248, 592-598.
DÍAZ I., VICENTE-CARBAJOSA J., ABRAHAM Z., MARTÍNEZ M., ISABEL-LAMONEDA I., CARBONERO P. (2003) The GAMYB protein from barley interacts with the DOF transcription factor BPBF and activates endosperm-specific genes during seed development. Plant J. 29, 453-464.
EHRHARDT D. GFP technology for live cell imaging. Current Opin Plant Biol. 6, 622-626.
FUQUA W.C., WINANS S.C. (1994) A LuxR-LuxI type regulatory system activates Agrobacterium Ti plasmid conjugal transfer in the presence of a plant tumor metabolite. J. Bacteriol. 176, 2796-1806.
JEFFERSON R.A. (1987) Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387-405. Koncz C, Langridge WHR, Olsson O, Schell J, Slazay, A. (1990) Bacterial and firefly luciferase genes in transgenic plants: advantages and disadvantages of a reporter gene. Dev. Genetics 11, 224-232.
MAAGD R.A, BRAVO A., CRICKMORE N. (2001) How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. Trends Genet. 17, 193-199.
MARTÍNEZ M., LÓPEZ-SOLANILLA E., RODRÍGUEZ-PALENZUELA P., CARBONERO P., DÍAZ I. (2003) Inhibition of plant-pathogenic fungi by the barley cystatiin Hv-CPI (gene Icy) is not associated with its cysteine-proteinase inhibitory properties. Mol. Plant-Microbe Interact. 16, 876-883.
MORTON R.L., SCHROEDER H.E., BTEMAN K.S., CHRISPEELS M.J., ARMSTRONG E., HIGGINS T.J.V. (2000) Bean a-amylase inhibitor I in transgenic peas (Pisum sativum) provides complete protection from pea weevil (Bruchus pisorum) under field conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3820-3825.
PETRI C., BURGOS L. (2005) Transformation of fruit trees. Useful breeding tool or continued future prospect?. Transgenic Res. 14, 15-26.
VASIL, I.K. (1994) Molecular improvement of cereals. Plant Mol. Biol. 25, 925-937.
ZUPAN J.R, MUTH T.R, DRAPER O., ZAMBRYSKI P. (2000) The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. Plant J. 23, 11-28.
