Sección: 16º symposium internacional sobre la problemática actual de las resistencias en cultivos mediterráneos
Los ensayos de fungicidas in vitro nos dan una estimación indirecta del valor práctico del producto y nos permiten detectar resistencias. A través de tres ejemplos vamos a ir viendo las dificultades que se presentan con determinados productos en el primer caso, la influencia de la presencia de cepas resistentes en el éxito de un tratamiento, en el segundo y, por último, un caso exitoso en el que se obtienen buenos resultados en campo con el producto seleccionado in vitro.
Los ensayos in vitro consisten en poner en contado directo el fungicida con el hongo para ver cómo afecta a su crecimiento. Su aplicación abarca tanto a ensayos de eficacia de productos fitosanitarios sobre un determinado hongo, detección de cepas resistentes, conocer mejor el modo de acción de un producto, etc.
La evaluación de la eficacia de los productos en campo tiene muchas más interferencias y resulta más compleja; por lo que una primera evaluación in vitro siempre nos dirige hacia los productos más eficaces. Sin embargo, los ensayos in vitro sólo dan una estimación indirecta del valor práctico del producto por lo que deberá contrastarse este resultado con los obtenidos posteriormente en campo. Un producto que es eficaz in vitro no necesariamente lo será en campo pues en su actuación influyen factores como la degradabilidad, persistencia, etc. Sin embargo, si un producto no es útil in vitro difícilmente lo será en campo.
En primer lugar daremos un pequeño repaso a los distintos tipos de ensayos in vitro para pasar luego a los casos prácticos.
El ensayo basado en el estudio del efecto de un producto sobre el crecimiento miceliar es de fácil aplicación cuando el hongo crece bien sobre medios de cultivo y se basa en la confrontación del hongo con concentraciones crecientes del fungicida añadidas al medio de cultivo de manera que la medida del crecimiento del micelio nos permite estimar el efecto del producto. Los ensayos deben realizarse siempre por duplicado o triplicado e incluir testigos que consisten en placas de medio sin fungicida.
En cuanto al método de medida sobre la germinación de esporas o conidios consiste en poner en contacto el producto con una suspensión de esporas o conidios del hongo, la acción sobre ellos se puede estimar una vez que se siembran en el medio apropiado y se ve la mortalidad respecto al testigo sin tratar.
En otros casos, los fungicidas tienen como modo de acción provocar una germinación anómala, en este caso lo que se hace es observar al microscopio la emisión de los tubos germinativos.
La eficacia de la inhibición del crecimiento del hongo vendrá dada también por el hecho de que la acción del producto sea fungicida o fungistática. Para conocer este aspecto, una vez obtenida la inhibición del crecimiento del micelio o de la germinación de esporas es necesario retirar el producto y volver a sembrar el hongo de manera que si no crece la acción del producto sería fungicida y si crece sin la presencia del producto sería fungistática.
Respecto al parámetro a evaluar consideramos que la tendencia muy arraigada de utilizar términos como dosis letal 50 (DL50, dosis de producto que mata la mitad del micelio/esporas del hongo) debe ser rechazada en favor de la concentración inhibitoria mínima (C.I.M., mínima concentración del producto que inhibe totalmente el crecimiento del hongo), puesto que al tratarse de microorganismos cuya tasa de generación es baja, conseguir reducir al 50% el inóculo no supone a nivel práctico más que en una tasa de generación se recuperen los niveles de inóculo iniciales.
Una vez repasados los principales aspectos de la realización de estos ensayos, el primer ejemplo que vamos a comentar es el estudio de la eficacia in vitro del permanganato potásico sobre una colección de hongos de suelo aislados de judía tipo granja asturiana (GONZÁLEZ Y FUEYO, 1993). Este es un caso especialmente indicado para discutir la utilidad de los ensayos in vitro y también para ver las dificultades que puede conllevar su realización según el producto que estemos estudiando. El permanganato potásico es un oxidante de materia orgánica que casi podríamos denominar como de acción universal pues su acción oxidante se produce sobre todo tipo de materia orgánica, por tanto, para la realización de este ensayo no se pueden utilizar medios orgánicos ni agar como solidificante. Este hecho nos hizo elaborar un medio inorgánico mínimo, que denominamos A1, en el que pudieran crecer los hongos en estudio: Rhizoctonia solani y varias especies del género Fusarium. Como solidificante se utilizó gel de sílice (FUNK Y KRULWICH, 1964).
En la Figura 1 se representan resultados de tres de las cepas ensayadas como representativas del estudio que detallado se encuentra ya publicado. En ella vemos la diferente C.I.M. que se alcanza en dos cepas distintas de F. oxysporum (1 y 2) que se sitúan en un caso entre 8 y 16 ?g/ml y en el otro entre 32 y 64 ?g/ml. Para la cepa de R. solani ensayada se alcanzan valores de CIM comprendidos entre 16 y 32 ?g/ml.
Los resultados obtenidos en todo el estudio, en el que se utilizaron en total 16 cepas aisladas en Asturias del cultivo de judía tipo granja asturiana, nos indicaron que el producto tenía una aceptable actuación como fungicida. Pero los datos corresponden a una situación en la que no existe materia orgánica que interfiera con el producto, situación que en la práctica agrícola es imposible de encontrar, por lo que la utilidad del producto en la práctica se reduce al tratamiento del agua de riego, donde es útil para mantener controlada la dispersión de patógenos por el agua, aspecto este que se comprobó posteriormente realizando un estudio en campo sobre el control de la dispersión de Phytopthora en cultivo de Petunia a través del agua de riego (datos sin publicar).
El siguiente ejemplo que vamos a comentar se refiere a un trabajo que propuso la Sección de Sanidad Vegetal del Principado de Asturias debido a las dificultades de tratar Rhizoctonia solani en algunos cultivos. R. solani es un hongo del suelo que causa problemas sanitarios en muchos cultivos hortícolas. Dentro de esta especie se han separado grupos de anastomosis según la capacidad o no de unirse las hifas. En este estudio (GONZÁLEZ, 2000) se incluyeron los siguientes productos: benomilo, metiltolclofos, pencicurón, tiabendazol, tiram y la mezcla de PCNB (24%) y etridiazol (6%). Se utilizaron tres aislamientos realizados sobre muestras de judía tipo granja asturiana, de los que se había comprobado previamente que causaban graves daños en judía (TELLO et al., 1990), y ocho cepas de colección de R. solani cedidas por el Dr. Ing. Javier Tello representativas de distintos grupos de anastomosis. Se estudió el efecto sobre el crecimiento miceliar y los resultados se muestran en la Tabla 1 en el que se representan los valores ensayados más próximos a la C.I.M.
Como podemos ver en la Tabla 1, se encuentra un número considerable de cepas de R. solani resistentes a productos específicos tales como el pencicurón y el metiltolclofós, concretamente un 54% en el primer caso y un 36% en el segundo.
Además estas cepas resisten concentraciones de 1.024 ?g/ml contrastando con otras que por el contrario son muy sensibles a ambos productos. Esto nos permite entender por qué ocurre el fenómeno que había motivado la realización del ensayo que era la disparidad de resultados obtenidos en los tratamientos que los técnicos realizaban en cultivos afectados por este patógeno. En la práctica nos vamos a encontrar que utilizando productos específicos frente al patógeno podemos tener un gran éxito o un gran fracaso según la cepa que esté actuando en campo. Mientras que con productos de amplio espectro los resultados serán moderadamente buenos sea cual sea la cepa a tratar.
Hemos comentado dos ejemplos que se han realizado hace algún tiempo y no quería dejar pasar la ocasión de citar uno de los últimos que hemos realizado.
En 2003, se detectó en Asturias la presencia de Pythium tracheiphilum en una explotación de lechuga del concejo de Villaviciosa (GONZÁLEZ et al, 2004) que no respondía a los tratamientos recomendados por los técnicos, concretamente propamocarb y fosetil-Al, por lo que procedimos a ensayar varios productos frente a la cepa causante del problema, incluidos estos dos. En la Figura 2 recogemos dos resultados significativos de este ensayo que son los obtenidos con propamocarb y con la mezcla de metalaxil y mancozeb, el primero totalmente ineficaz frente a esta especie de Pythium y el segundo el que mejores resultados ha dado in vitro (GONZÁLEZ et al, 2004).
Tras la recomendación pertinente al agricultor se solucionó el problema, por lo que este ejemplo nos sirve para ilustrar aquellos casos en los que en campo se obtiene una buena correlación con los resultados obtenidos en laboratorio y que justifican plenamente la realización de este tipo de ensayos con todas sus limitaciones.
Para concluir comentar tan solo que en nuestro laboratorio proseguimos realizando ensayos in vitro siempre que nos encontramos con hongos de difícil o desconocido tratamiento, así podemos citar el estudio que se está completando en estos momentos sobre Cryphonectria parasitica, hongo que causa el chancro del castaño y del que ya se ha aportado un avance en una reunión científica (GONZÁLEZ-VARELA Y GONZÁLEZ, 2005) y el que se está realizando sobre Exserohilum turcicum un hongo que está produciendo graves daños en el maíz en la zona norte, enfermedad que en Asturias se conoce como "niebla del maíz", aunque tal vez en estos dos casos no sea fácil obtener un buen control químico de estas enfermedades. En ambos casos no se trata de hongos de suelo por lo que no he incluido más detalles del trabajo que se está realizando con ellos.
BIBLIOGRAFÍA
FUNK, H.B.; KRULWICH, T.A., 1964. Preparation of clear silica gels that can be streaked. J. Bacteriol. 88: 1200-1201.
GONZÁLEZ, A.J. Y FUEYO, M.A. 1993. Ensayo in vitro del permanganato potásico frente a hongos patógenos aislados de judía "granja asturiana" (Phaseolus vulgaris L.) Bol. San. Veg. Plagas, 19:681-686.
GONZÁLEZ, A.J. 2000. Ensayo in vitro de la eficacia de productos fitosanitarios frente a Rhizoctonia solani. Actas de Horticultura 28: 129-133.
GONZÁLEZ, A.J.; TELLO, J.C. Y HERRERO, M.L. 2004. First report of Pythium tracheiphilum causing wilt and leaf blight on lettuce (Lactuca sativa) in Spain. Plant Disease. Vol. 88 (12): 1382.
GONZÁLEZ, A. J.; MENÉNDEZ, F. Y FERREIRA, J. J. 2004. Valoración de la eficacia in vitro de fungicidas frente a Pythium sp. aislado de lechuga. XII Congreso de la Sociedad Españñola de Fitopatología. Lloret de Mar, septiembre de 2004.
GONZÁLEZ-VARELA, G. Y GONZÁLEZ, A.J. 2005. Valoración de la eficacia in vitro de fungicidas frente a aislamientos asturianos de Cryphonectria parasitica. 1ªª Reunión del Grupo Especializado Microbiología de Plantas. 6-8 de junio, pag 7.
TELLO, J.C.; GONZALEZ, A.J.; VARÉS, F. Y FUEYO, M.A. 1990. Espermatoflora de las judías (Phaseolus vulgaris L.) para siembra en Asturias. ITEA, 86 (2): 67-74.
