Se presenta la utilidad y adecuación de la técnica de cultivo in vitro en la detección de resistencia al herbicida tribenurón-metil en poblaciones de Pavaver rhoeas. La optimización de esta técnica pasa por evitar una mortalidad precoz de plantas mediante el aporte de los nutrientes necesarios para cada especie en concreto, así como por eliminar la presencia de microorganismos contaminantes que puedan acelerar esta mortalidad o incluso dificultar la interpretación de los resultados. El porcentaje de plantas sanas, cloróticas o necróticas, constituye el parámetro que mejor cuantifica, en esta especie, la respuesta diferencial de la población en función de su nivel de resistencia. Optimizado el método, éste ha sido validado posteriormente en otras poblaciones de esta misma especie.
La presencia de biotipos de malas hierbas resistentes a herbicidas ha venido detectándose con relativa frecuencia en nuestro país durante los últimos años, hasta el punto de situarse en el quinto lugar a nivel mundial, y segundo a nivel europeo con mayor número de biotipos resistentes (HEAP, 2005).
En cereales de invierno, las especies de malas hierbas en las que se han detectado biotipos resistentes a herbicidas son Lolium rigidum y Papaver rhoeas. El primer caso de resistencia a herbicidas por parte de Papaver rhoeas, corresponde a una población resistente a 2,4-D, a partir de datos aportados por Claude et al. (1998) de Cataluña, aunque las primeras voces de alarma ya se dieron a conocer a principios de la década de los años 90 (TABERNER observación personal). En Papaver rhoeas, a su vez, se ha detectado resistencia a tribenurón-metil, resistencia ya conocida y más frecuente en otras especies. Este herbicida se introdujo en España en 1986 y dada su alta eficacia a dosis bajas, baja toxicidad y amplia selectividad de cultivos (SAARI et al., 1994) su uso se extendió de forma rápida para el control de dicotiledóneas, especialmente en cereales de invierno. En nuestro país y en algunos casos, este herbicida se aplicó en campos donde ya existían poblaciones resistentes a 2,4-D; de este modo y tras un uso repetido de esta materia activa, algunas de estas poblaciones han llegado a desarrollar también resistencia a este herbicida. La población detectada en Cataluña resistente a 2.4-D, constituyó también el primer caso de resistencia a tribenurón-metil (CLAUDE, et al. 1998). Oros casos posteriores de resistencia a este herbicida han sido confirmados en Navarra (TIEBAS et al., 2001) así como también en Italia (SATTIN, 2001) y Grecia (KOTOULA-SYKA, 1998). A partir de prospecciones realizadas por la zona norte del territorio español y tras ensayos de laboratorio, se ha confirmado la presencia de poblaciones de Papaver rhoeas resistentes a 2.4-D y/o a tribenurón-metil en las provincias de Barcelona, Lleida, Huesca, Zaragoza, Navarra, la Rioja y Burgos (TABERNER et al., 2001; CIRUJEDA, 2001).
El desarrollo de un test de diagnóstico rápido de resistencias en malas hierbas ha constituido una necesidad metodológica prioritaria. Algunos autores han desarrollado bioensayos para la detección de resistencias en gramíneas anuales, haciendo germinar semillas de poblaciones susceptibles de mostrar resistencia a un determinado herbicida en placas Petri con soluciones de diferentes dosis de dicho herbicida (HEAP y KNIGHT 1986, MURRAY et al. 1996, O?DONOVAN et al. 1996). En este sentido Cirujeda et al. (2001) han desarrollado un método eficaz de detección de resistencias en el que analizan los primeros estadios de la germinación de las semillas en placas Petri que contienen soluciones gelificadas con diferentes concentraciones de tribenurón-metil.
En todas estas técnicas la determinación de la resistencia debe realizarse rápidamente durante los primeros estadios de la germinación, puesto que la metodología que se utiliza mantiene la viabilidad de las plántulas tan sólo unos pocos días tras su germinación. Su optimización pasa por evitar esta mortalidad precoz mediante el aporte de los nutrientes necesarios para cada especie en concreto, así como por eliminar la presencia de microorganismos contaminantes que pueden acelerar esta mortalidad o incluso dificultar la interpretación de los resultados.
El cultivo in vitro sobre medios nutritivos completos ofrece estas posibilidades y permite acelerar el desarrollo de la planta respecto al cultivo in vivo, ya que pueden añadirse al medio de cultivo cualquier tipo de reguladores de crecimiento que potencien el desarrollo de la planta; además se optimizan las condiciones ambientales de su cultivo, principalmente iluminación y temperatura. De esta forma los ensayos pueden hacerse en condiciones controladas y repetitivas, manteniendo las plántulas en buen estado durante todo el periodo de tiempo, e incluso prolongarlo si fuera necesario. Con este fin, y partiendo de los resultados de Curujeda et al. (2001), se ha ensayado la adecuación de la técnica de cultivo in vitro para la detección temprana de resistencias al tribenurón-metil en poblaciones de Papaver rhoeas.
Material y métodos
De forma previa a la puesta a punto de la técnica de cultivo in vitro se realizaron varios ensayos con el fin de optimizar los componentes del medio así como los requerimientos nutritivos para posibilitar la germinación de las semillas de Papaver rhoeas. Tras varios ensayos preliminares se utilizó finalmente medio de cultivo MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962) diluido a la mitad con el fin de reducir la concentración salina, como gelificante se usó agar al 1,3% y se añadió al medio sacarosa al 2%. Con el fin de favorecer la germinación de las semillas se realizó también un aporte de 300 mg/l de ácido giberélico.
La esterilización del medio de cultivo se realizó en autoclave a 121°C durante 20 minutos.
Las semillas de Papaver rhoeas se esterilizaron en una solución con cloro activo 1% (v/v) y a continuación se procedió a su siembra en placas de Petri bajo condiciones de esterilidad. Realizada la siembra en las placas, éstas se introdujeron en una cámara de cultivo bajo fotoperíodo de 16h luz, a 20±1°C de temperatura diurna y 10°C de temperatura nocturna, con una intensidad de luz de 20 ?mol s-1 m-2.
Para evaluar la adecuación de la técnica de cultivo in vitro en la detección de resistencias al tribenurón-metil, se emplearon cuatro poblaciones de Papaver rhoeas de diferente origen. Dos de ellas de resistencia conocida (R1 y R2) y otras dos sensibles a dicho herbicida (S1 y S2). La resistencia y sensibilidad de dichas poblaciones había sido testada en campo de forma previa (CIRUJEDA, 2001).
Para cada población se realizaron cuatro tratamientos: el tratamiento control más tres dosis de tribenurón-metil a 4, 8 y 12 ?M, siendo la dosis intermedia la equivalente a la dosis comercial aplicada en campo. Para cada población y dosis de herbicida se sembraron 25 semillas por placa y se realizaron cuatro repeticiones. Se probaron a su vez dos formas distintas de aplicación del herbicida: en preemergencia, incorporándolo al medio de cultivo antes de la siembra de las semillas y en postemergencia, aplicándolo, a los 14 días de la siembra, sobre las plántulas ya desarrolladas y en un estadio vegetativo de una a dos hojas verdaderas.
Se comprobó que la aplicación en pre-emergencia ?mediante incorporación del herbicida al mediopermitió asegurar una mejor homogeneidad de la dosis que recibían las plántulas, por lo que se utilizó este procedimiento para el resto del ensayo.
Los parámetros analizados como posibles indicadores de resistencia o sensibilidad al tribenurón- metil fueron la tasa de germinación, el porcentaje de plántulas cloróticas, el porcentaje de plántulas necróticas y el porcentaje de plántulas sanas.
Una vez definida la metodología del ensayo con las cuatro poblaciones utilizadas y seleccionado el parámetro que permite cuantificar la respuesta diferencial entre poblaciones sensibles y resistentes, se validó el ensayo con siete poblaciones más de Papaver rhoeas (P1 a P7) cuyo grado de resistencia se desconocía a priori y que posteriormente, tras obtener los resultados in vitro, se comprobó con los historiales de campo de cada una de dichas poblaciones.
El diseño experimental desarrollado consistió en un modelo aleatorizado factorial doble (factor población y factor dosis de herbicida) sin bloques. Con el fin de diferenciar poblaciones sensibles y resistentes se realizó un análisis de varianza. En aquellos casos en que se detectaron diferencias significativas entre poblaciones (p<0,05), se determinaron las diferencias entre las medias de dichas poblaciones mediante el método de Tukey.
Resultados y discusión
El sistema de cultivo in vitro utilizado permitió obtener un cultivo sano libre de contaminaciones fúngicas y bacterianas y permitiendo mantener las plantas en buen estado durante un tiempo superior a las cuatro semanas (Figura 1).
Tras la incorporación del herbicida en el medio, el porcentaje de germinación, respecto al control, se vio reducido de forma significativa en las cuatro poblaciones, si bien en aquellas resistentes (R1 y R2) las semillas que germinaron formaron plántulas cuyo desarrollo durante las tres primeras semanas de cultivo fue mayoritariamente normal y semejante al de las plántulas control cultivadas sin herbicida; mientras que las plántulas de las poblaciones sensibles (S1 y S2) comenzaron a mostrarse cloróticas y a inhibir rápidamente su desarrollo hasta llegar a necrosarse y morir en estado de cotiledones (Figura 2). Estos mismos síntomas ya habían sido observados en poblaciones sensibles por parte de Cirujeda et al. (2001). Para las tres dosis de herbicida ensayado, según la población fuera resistente o sensible, las diferencias en el porcentaje de plantas cloróticas y necróticas respecto a plantas sanas, eran significativamente evidentes a los 14 días de cultivo (Figura 3).
Las poblaciones sensibles, a las dos semanas de cultivo y tras la aplicación de herbicida, no mostraron un buen estado de desarrollo. Dado que las plantas cloróticas acababan todas muriendo, el parámetro que mejor determinaba la resistencia o sensibilidad al herbicida era el porcentaje de plantas sanas o, lo que es lo mismo, el porcentaje de supervivencia de semillas germinadas. Las poblaciones resistentes y sensibles pudieron distinguirse claramente a las dos semanas de siembra, por lo que el índice de resistencia se calculó para esa fecha.
Las mejores dosis que permitieron discriminar poblaciones resistentes de sensibles fueron 4 y 8 ?M (Figura 4), descartando la dosis más alta de 12 ?M por llegar a afectar algunas plántulas de las poblaciones resistentes.
La aplicación de este método a las siete poblaciones (P1 a P7), de resistencia a priori desconocida (Tabla 1), y tras la estimación del porcentaje de plantas sanas a los 14 días después de la siembra, permitió clasificar a dos de ellas (P4 y P5) como sensibles (todas las plántulas mostraron clorosis y posteriormente necrosis) y cuatro de ellas (P2, P3, P6 y P7) como resistentes (con un nivel de supervivencia de plántulas superior al 90%). La población P1 mostró un grado de resistencia intermedio, con un porcentaje de plantas sanas inferior al 75%. Estos resultados coincidieron de forma exitosa con el grado de resistencia o sensibilidad de las respectivas poblaciones mediante comparación con datos obtenidos en campo (CIRUJEDA, 2001).
Las ventajas de la técnica de cultivo in vitro respecto a otros métodos de detección de resistencia residen en la posibilidad de mantener las plantas sanas y libres de contaminaciones fúngicas y bacterianas durante todo su ciclo biológico debido a las condiciones asépticas en las que se trabaja y evita, además, la rápida mortalidad natural por falta de nutrientes. De esta forma se eliminan todas las interferencias de las variaciones del medio exterior de forma que el test es altamente repetitivo. La posibilidad de obtener resultados en sólo dos semanas representa otra de las ventajas respecto a los métodos realizados in vivo, en campo o en invernadero, cuyos resultados suelen obtenerse en un tiempo muy superior (más de dos meses).
La precisión, fiabilidad, y capacidad de mantener el cultivo durante un tiempo indefinido y con total independencia ambiental, permite que la respuesta al tratamiento herbicida en función de su resistencia o sensibilidad, no se vea enmascarada por otros factores como el estado de desarrollo del material vegetal o de las condiciones climáticas durante su cultivo o aplicación del herbicida.
La validación de la técnica de cultivo in vitro con el fin de detectar resistencias a tribenurón-metil en Papaver rhoeas, abre nuevas expectativas en la detección de resistencia a otros herbicidas, tanto en ésta como en otras especies.
Agradecimientos Este trabajo forma parte del proyecto de investigación AGL2002-01513 financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología. Queremos agradecer a la Unitat de Malherbología i Fitoreguladors del Servei de Sanitat Vegetal de la Generalitat de Catalunya, el suministro de las semillas de los distintos biotipos de Papaver rhoeas utilizados en este ensayo.
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