Sección: Malherbología
Abstract: La degradación de los productos fitosanitarios en condiciones naturales tiene lugar a través de procesos tanto abióticos como bióticos, y dentro de los factores abióticos la fototransformación es la ruta principal de degradación. Por lo tanto, los estudios de estas transformaciones fotolíticas son una contribución para determinar el destino final de estos xenobióticos, especialmente en ambientes acuáticos.
El estudio de la fotólisis que tiene lugar en herbicidas relativamente inestables, como es el caso de los herbicidas ciclohexanodionas, así como la identificación de sus productos de fotodegradación, puede contribuir a un mejor entendimiento del comportamiento de estos productos fitosanitarios en el medioambiente.
En este trabajo se ha estudiado la degradación fotolítica de tres herbicidas de la familia de las ciclohexanodionas con el fin de conocer su cinética de degradación y los productos que se forman. Asimismo, se pone de manifiesto el problema que puede suponer la aplicación de estos herbicidas en el campo expuestos a condiciones de luz solar.
Para evaluar el destino de los productos fitosanitarios en el medioambiente, es muy importante tener en cuenta la influencia de los factores bióticos y abióticos. Entre los factores químicos abióticos que afectan el comportamiento de los productos fitosanitarios, las reacciones fotoquímicas son la ruta más importante de degradación. En las capas de la superficie de los sistemas acuáticos, las reacciones fotoquímicas juegan un papel fundamental en la transformación y degradación de los productos fitosanitarios.
Por otra parte, es importante desarrollar métodos para la detección de los productos que se forman en los procesos de fotodegradación así como identificar dichos compuestos. Estos productos pueden presentar importantes diferencias respecto a la sustancia activa tanto en sus propiedades físico-químicas como fitotóxicas. Diferencias en la solubilidad en agua y coeficientes de partición, van a permitir que presenten una tendencia diferente a filtrarse al agua subterránea.
En los estudios realizados para simular las condiciones medioambientales en las aguas naturales, la luz solar se ha empleado como fuente de luz. Sin embargo, la intensidad de la luz solar y las longitudes de onda varían debido a las variaciones tanto estacionales como durante el día, por lo que para obtener una mayor reproducibilidad y control en los experimentos se emplean lámparas que simulan la luz solar.
Con respecto a los herbicidas, la extensión a la cual un herbicida puede ejercer su efecto fitotóxico puede ser, entre otros factores, función de la estabilidad del herbicida en el medioambiente. La información de los factores que afectan a la estabilidad es un requisito para el claro entendimiento del modo de acción de un herbicida y de su dosis herbicida efectiva. Con respecto a los herbicidas ciclohexanodionas no esta claro si son los productos de degradación el agente herbicida real.
Las ciclohexanodionas son herbicidas fácilmente degradables. Los estudios realizados se han centrado principalmente en el cletodim y setoxidim.
Diferentes estudios muestran que estos herbicidas son fácilmente degradables en condiciones tanto ácidas (FALB y col, 1991) como básicas (SHOAF y CARLSON, 1986), en mezclas de acetonitrilo/agua (FALB y col, 1991), en superficies (SHOAF y CARLSON, 1992) y la fotodegradación del cletodim aumentaba de 7 a 27 veces en presencia de diferentes adyuvantes (FALB y col, 1990).
En los estudios de degradación de setoxidim en agua, se observó que el setoxidim era extremadamente lábil en solución acuosa y que sufre varias reacciones de transformación para generar una mezcla compleja de productos de degradación observándose una rápida descomposición en condiciones alcalinas para dar lugar a productos de degradación más polares (SHOAF y CARLSON, 1986).
En nuestro grupo de trabajo se ha estudiado el efecto que tiene la cloración de las aguas con diferentes agentes desinfectantes en herbicidas de esta familia. Debido a la baja repetibilidad que se obtenía en bioensayos realizados con el herbicida tepraloxidim cuando se empleaba agua clorada, se llevó a cabo un estudio de su estabilidad, donde se observó que el tepraloxidim tenía una vida media menor de 1 hora en agua potable y menor de 5 horas en una solución de cloraminas (SANDÍN-ESPAÑA y col., 2003). Asimismo, estudios realizados con otros herbicidas ciclohexanodionas como aloxidim, tralkoxidim y cletodim con hipoclorito sódico mostraron la rápida degradación de estos compuestos con vidas medias menores a los 2 minutos (SANDÍN-ESPAÑA y col., 2005). A su vez, se ha demostrado que la presencia de residuos de cloro en el agua destilada degrada muy rápidamente a los herbicidas setoxidim, cletodim y profoxidim (SANDÍN-ESPAÑA y col., 2005).
Como se ha visto, las ciclohexanodionas son herbicidas dependientes del pH, y por lo tanto susceptibles a hidrólisis química a pH ácidos y básicos.
Por lo tanto, podemos imaginar fácilmente que a pH neutros, la fotodegradación puede llegar a ser una ruta muy importante de degradación.
Con respecto a estudios realizados sobre fotodegradación de ciclohexanodionas, Falb y col., (1991) desarrollaron un método mediante cromatografía líquida para separar 31 productos de fotodegradación del cletodim. Shoaf y Carlson, (1992) estudiaron la degradación del setoxidim en luz ultravioleta observando que este herbicida se degradaba el 50% en 10 minutos en medio acuoso. Este producto daba lugar a tres compuestos uno de ello se identificó como la sulfona. Estos autores sugieren que debido a que las aplicaciones de campo se realizan normalmente durante la luz del día, es probable que los niveles de setoxidim sean bajos mientras que los niveles de los productos de degradación aumenten en estas preparaciones y que un derivado del setoxidim pudiera actuar como agente herbicida. Campbell y Penner (1985) observaron una completa degradación de setoxidim a las 3 horas con luz artificial, observando 5 productos de degradación no identificados, presentando dos de ellos actividad fitotóxica y sugieren, al igual que Shoaf y Carlson, que cuando este herbicida se exponga a mayores intensidades de luz en el campo, es posible que la transformación sea muy rápida, siendo posible que los efectos fitotóxicos se deban a los productos de degradación.
Las ciclohexanodionas (CHD) comúnmente conocidas como DIM´s, son herbicidas introducidos a principios de la década de los ochenta del pasado siglo, como herbicidas selectivos de post-emergencia para el control de malas hierbas gramíneas en cultivos de cereales. Estos herbicidas, son generalmente activos a bajas concentraciones y presentan una baja toxicidad, lo cual hace que puedan ser ampliamente utilizados. Su vía de absorción es foliar y se translocan a los meristemos donde inhiben la acetil-CoA carboxilasa (ACCasa), enzima que cataliza el primer paso común para la síntesis de ácidos grasos (INCLEDON y col., 1997).
En cuanto a su estructura química, además del anillo ciclohexano-1,3-diona, es esencial para la actividad fitotóxica el grupo etoxiimino unido en la posición 2 del anillo (LICHTENTHALER, 1990). En la Figura 1 se muestran las estructuras químicas de los compuestos pertenecientes a esta familia que se han estudiado.
En este trabajo se presenta el estudio cinético de la fotodegradación de herbicidas de la familia de las ciclohexanodionas (aloxidim, setoxidim y profoxidim) (Figura 1) mediante un simulador solar con lámpara de xenon en disolución acuosa y el desarrollo de métodos mediante cromatografía líquida para la separación e identificación de los productos de degradación.
Material y métodos
Patrones y disolventes
Los patrones analíticos de setoxidim ((±)-(EZ)-2- (1-etoxiiminobutil)-5-(2-etilsulfanilpropil)-3-hidroxi-2-ciclohexenona, 99,3 %) y profoxidim (2- (1-[2-(4-clorofenoxi)propoxiimino]butil)-3-hidroxi-5-(tetrahidro-2H-tiopiran-3-il)-2-ciclohexenona), 99,6 %)(Figura 1) fueron suministrados por BASF Ltd (Limburgerhof, Alemania). El patrón analítico de aloxidim (3-[(E)-1-(aliloxiimino)butil]-2- hidroxi-6,6-dimetil-4-oxo-3-ciclohexencarboxilato de metilo, 98 %) (Figura 1) fue adquirido de Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Alemania).
Todos los disolventes empleados para preparar las muestras estándar en los estudios de fotólisis y durante el análisis cromatográfico fueron de grado HPLC. Como disolventes para la cromatografía líquida se emplearon acetonitrilo y agua de grado HPLC suministrados por Lab-Scan (Stillorgan, Co. Dublín, Irlanda). El ácido fórmico (grado analítico, 98%) fue obtenido de la casa comercial Panreac (Barcelona, España).
Se prepararon disoluciones patrón de 50 mg/L de los herbicidas y se almacenaron en oscuridad a 4 ºC y fueron usadas para preparar soluciones más diluidas para la calibración y para los estudios de fotodegradación.
Los patrones de cletodim se pesaron y se disolvieron en la mínima cantidad de acetonitrilo en un matraz aforado, enrasándose hasta el volumen deseado con agua. Las disoluciones son estables durante 10 días. Las disoluciones de setoxidim y aloxidim se pudieron preparar directamente disolviéndolo en agua gracias a la alta solubilidad de este compuesto siendo estas disoluciones estables al menos durante 3 meses. Los patrones de profoxidim se prepararon disolviéndolos en la mínima cantidad de metanol, debido a su baja solubilidad en otros disolventes como acetonitrilo y acetona, y enrasándose hasta el volumen deseado con agua. Las disoluciones de profoxidim son estables durante 1 mes.
Equipos
La disminución de la concentración de los herbicidas y la evolución de los principales fotoproductos se determinó mediante un cromatógrafo de líquidos HPLC Agilent serie 1100 con bomba cuaternaria (modelo G1354A), muestreador automático (modelo G1313A), detector de diodo array (modelo G1315B) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Los datos cromatográficos fueron recogidos y analizados mediante la estación de datos LC 3D (modelo G1319A). Los compuestos se separaron mediante una columna Nova- Pack C18 (150 x 3.9 mm, 4 ?m de partícula) suministrado por Waters (Milford, MA, USA).
El volumen de inyección fue en todos los casos de 50 ?l y la longitud de onda fue la máxima obtenida para cada herbicida.
Los experimentos de fotodegradación se llevaron a cabo en un equipo de degradación solar Suntest CPS+ (ATLAS, Linsengericht, Alemania) equipado con una lámpara de xenon, con una intensidad de radiación de 500 W/m2 y un filtro con longitudes de onda > 290 para simular el espectro de emisión de la luz solar.
Estudios de degradación en solución acuosa
En este trabajo se ha estudiado las cinéticas de fotodegradación que tiene lugar en tres herbicidas de la familia de las ciclohexanodionas en agua de grado HPLC y la formación y evolución de los principales productos de fotodegradación formados.
Debido a que existen muchos factores que influyen en la degradación en un medio acuoso natural, como la presencia de los ácidos húmicos o complejos de sales metálicas (Fe+3, Cu+2...), que generalmente catalizan procesos de degradación, los experimentos se han realizado en agua de grado HPLC para estudiar la fotólisis directa en estos herbicidas, de forma que otros factores no interfieran en el resultado. Así, se realizaron una serie de ensayos previos que permitieron estimar el porcentaje de degradación de cada herbicida según el tiempo de radiación, proporcionando la información necesaria para planificar la duración de los experimentos y los intervalos a los cuales debía detenerse la reacción.
Se empleó una concentración de herbicida de 5 ppm, que permite seguir directamente la cinética de degradación mediante la inyección directa de la muestra en el cromatógrafo de líquidos y, lo que es más importante, permite estudiar los posibles productos de degradación que a concentraciones más bajas de herbicida no podrían ser detectados.
Para ello, se dispusieron en vasos de precipitados 10 mL con una concentración de herbicida de 5 ppm. Una vez expuesto el herbicida a la radiación, la solución se enrasa a 10 mL para corregir las perdidas por evaporación. A continuación las muestras son analizadas en el equipo HPLC.
En los tres herbicidas las soluciones se prepararon en el momento de realizar los experimentos ya sea para el calibrado o para la realización de los estudios fotolíticos.
Se realizaron ensayos previos para optimizar las condiciones cromatográficas con el fin de poder detectar la máxima cantidad de productos de degradación y poder seguir su evolución.
Para el análisis cromatográfico se tomaron 50 ?L de muestra después de detener la reacción y se inyectaron por duplicado en el sistema cromatográfico.
El flujo fue en todos los casos de 1 mL/min. La fase móvil fue acetonitrilo/agua con un 0,1% de ácido fórmico. En ninguno de los tres herbicidas fue necesario el empleo de preconcentración de muestra, ya que las concentraciones de los herbicidas fueron suficientemente altas para ser detectadas por el equipo.
La concentración de los herbicidas fue calculada por comparación del área de los picos con aquellas obtenidas de las soluciones estándar. La calibración externa se realizó inyectando las soluciones estándar de concentración conocida en el cromatógrafo de líquidos en las mismas condiciones.
Ajuste a cinética de primer orden y cálculo de vidas medias
La degradación de los herbicidas se estudió asumiendo una cinética de pseudo-primer orden, descrita por la ecuación:
C = Co e ?k t [1]
donde Co es la concentración inicial del herbicida (mg/L), C es la concentración alcanzada (mg/L) a tiempo t (s, min o h) y k es la constante de degradación de pseudo-primer orden (s-1, min-1 o h-1). Para cada experimento calcularon las constantes de degradación y los coeficientes de correlación (r2).
Las vidas medias (t1/2) de los compuestos estudiados se calcularon a partir de la constante de degradación k según la ecuación:
t 1/2 = ln 2/k
Los parámetros k y Co se obtuvieron mediante regresión no lineal de las concentraciones medidas a diferentes tiempos con la ecuación [1]. Para ello, se empleó el paquete de software Statgraphics Plus.
Resultados y discusión
Las condiciones cromatográficas empleadas para el estudio cinético de degradación del profoxidim fueron 95% de acetonitrilo y 5% de agua (0,1% ácido fórmico), con una longitud de onda máxima de 194 y 230 nm. En estas condiciones el tiempo de retención fue de 1,9 min. En el caso del setoxidim y aloxidim fue necesario el empleo de gradientes que se describen en la Tabla 1. El setoxidim presentó dos longitudes de onda máxima a 210 y 255 nm y el aloxidim a 260 nm. Con estos métodos cromatográficos el setoxidim tiene un tiempo de retención de 6,1 min y el aloxidim de 5,24 min.
Para el estudio del profoxidim y setoxidim se seleccionaron las longitudes de onda de 230 y 255 nm respectivamente debido a las interferencias que presentaban los disolventes a esas longitudes de onda que dificultaban la correcta cuantificación de los herbicidas.
Para conocer la concentración de los herbicidas en cada momento del estudio cinético se calcularon las rectas de calibración entre 0,1 y 15 ppm (n = 7) (Tabla 2).
Estudio de fotodegradación del profoxidim
Un primer estudio cinético de degradación mostró una degradación muy rápida del profoxidim. Como se puede observar en la Figura 2 después de una hora de radiación tiene lugar la completa degradación del herbicida.
También se observó que la degradación de profoxidim da lugar a varios productos de degradación minoritarios muy polares que eluían con el frente cromatográfico. El desarrollo de otros métodos cromatográficos permitió la separación de dichos productos.
Sin embargo, no fue posible seguir su evolución durante el desarrollo del experimento debido al alto número de productos y su baja absorción en el espectro ultravioleta.
En la Figura 2 se muestra la cinética de degradación.
La línea continua representa el mejor ajuste a la ecuación cinética de pseudo-primer orden.
A partir de los resultados obtenidos experimentalmente, y teniendo en cuenta las ecuaciones descritas se calculó una constante cinética de k=0,059 min-1 y un tiempo de vida media de 11,61 min con un coeficiente de determinación r2 = 0,98.
Se pone de manifiesto que los datos se ajustan bien a la ecuación cinética de pseudo-primer orden.
Estudio de estabilidad del setoxidim
Con respecto a la degradación del setoxidim, al igual que tiene lugar con el profoxidim, tiene lugar una rápida fotodegradación. A los 65 min. tiene lugar prácticamente la completa degradación del herbicida.
En la Figura 3 se representa la cinética de degradación solar mediante la simulación solar con lámpara de xenon. La constante de degradación obtenida fue de 0,050 min-1 y un tiempo de vida media de 12,83 min., con un coeficiente de determinación, r2 = 0,99.
Con respecto a los productos de degradación que se forman en la fotólisis, a diferencia de lo que ocurría en el profoxidim, se observa un producto principal de fotodegradación, que aparece desde los primeros minutos de degradación del setoxidim y del cual se siguió su evolución hasta la desaparición del herbicida (Figura 4).
Este producto eluye según las condiciones cromatográficas desarrolladas a 2,27 min. y presenta dos máximos de absorción en el espectro ultravioleta a 252 y 292 nm (Figura 5). También se observó la aparición de otros dos productos minoritarios durante el desarrollo del experimento de fotólisis con tiempos de retención de 1,8 y 3,7 min. que presentaban sus máximos de absorción a 256 nm.
Estudio de fotodegradación del aloxidim
Con respecto a la fotodegradación del aloxidim, al igual que ocurre con los otros dos herbicidas de la familia, tiene lugar una rápida degradación por efecto de la radiación solar simulada. A los 65 min. de exposición a la radiación se produce la prácticamente completa degradación del aloxidim.
En la Figura 6 se representa la cinética de fotodegradación del aloxidim. La constante de degradación obtenida fue de 0,056 min-1y un tiempo de vida media de 12,38 min., con un coeficiente de determinación r2 de 99,78%.
En el caso del aloxidim se observó que su fotodegradación da lugar a un producto de degradación principal. Este fotoproducto eluía con un tiempo de retención de 1,7 min. En la Figura 7 se puede observar la evolución de dicho producto de degradación hasta la completa degradación del aloxidim.
En la Figura 8 se representan los diferentes cromatogramas donde se puede observar la evolución de la reacción de fotodegradación a diferentes tiempos de radiación. En las condiciones cromatográficas optimizadas para su detección y presenta dos máximos de absorción de 256 y 290 nm.
Conclusiones
A la vista de los resultados obtenidos de esteestu dio, se puede concluir que los herbicidas ciclohexanodionas estudiados sufren una degradación muy rápida por efecto de la luz solar simulada en disolución acuosa. Los tres herbicidas estudiados se degradan completamente a los 65 minutos de exposición a la luz presentando una vida media inferior a 15 minutos en todos los casos. Por lo tanto, estos herbicidas son muy sensibles a la luz por lo que se tendría que tener especial cuidado en el momento de su aplicación en el campo, así como en los estudios de laboratorio, donde las disoluciones de estos compuestos deberán estar preservadas de la luz para evitar degradaciones.
El proceso de fotodegradación de estos herbicidas, en el caso del setoxidim y el aloxidim evoluciona a la formación de compuestos mayoritarios desconocidos, de los que no se conoce su comportamiento medioambiental y que pueden formarse cuando se aplican estos herbicidas en el campo bajo condiciones de luz solar. Actualmente, la separación e identificación de estos productos de fotodegradación se están estudiando en nuestro grupo.
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