En este estudio se analizaron 35 parcelas de albaricoquero tradicionales cultivadas con la variedad ?Búlida? que mostraban síntomas de al enfermedad conocida como "Viruela" se analizaron en cuatro áreas diferentes, incluyendo Pliego, Mula y Cieza en la Región de Murcia y Albacete en Castilla La Mancha. En cada parcela fueron estudiados cuatro árboles con y sin síntomas de "Viruela". En total 700 frutos y 140 muestras de hojas se analizaron a partir de los 140 árboles seleccionados. Tanto los frutos como las hojas se analizaron mediante ELISA, hibridación molecular y RT-PCR para la detección de Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV).

Además, se utilizó la prueba de RT-PCR múltiple para la detección de otros virus incluyendo Plum pox virus (PPV), Apple mosaic virus (APMV), Prunus necrotic ring spot virus (PNRSV), Prune dwarf virus (PDV), Apricot latent virus (APLV), Plum bark necrosis and stem pittingassociatedvirus (PBNSPaV), y American pit plum latent virus (APLPV). Por último, mediante hibridación molecular y RT-PCR específica se analizaron para la detección de los viroides Hopstunt viroid (HSVd) y Peach latent mosaic viroid (PLMVd). Todos los frutos que mostraron síntomas de "Viruela" fueron ACLSV positivo mediante ELISA y RT-PCR. Además, se han detectado otros virus en las parcelas infectadas como PNRSV (31% de los albaricoqueros analizados), PBNSPaV (22% de los árboles), APLV (6%), PDV (11%), y APMV (1%). No hubo árboles infectados de PPV ni de APLPV. La presencia de HSVd también fue detectada en el 96% de los árboles analizados. Sólo dos de los árboles analizados (1,5%) no presentaron ninguno de los virus analizados. Estos resultados indican la alta tasa de infección viral en las parcelas de albaricoquero tradicional ?Búlida? tanto en Murcia como en Albacete y suponen la primera identificación de APLV y PBNSPaV en albaricoquero en España. Además, estos resultados sugieren que ACLSV está estrictamente relacionada con la "Viruela" aunque en estos momentos estamos estudiando el sinergismo de ACLSV con otro virus en la expresión de síntomas de "Viruela".

 

INTRODUCCIÓN

La especie albaricoquero es una de las principales dentro de los frutales de hueso. La producción mundial supera los 3 Mt siendo España el décimo país productor con unas 90.000 t (FAO, 2008). En nuestro país, el cultivo del albaricoquero ocupa el tercer lugar en importancia tras el melocotonero y el ciruelo. La superficie destinada a su cultivo son unas 18.000 ha, de las cuales unas 10.000 ha se encuentran en la Región de Murcia, 4.000 ha en la Comunidad Valenciana, 2.000 ha en Castilla La Mancha, sobre todo en la provincia de Albacete, y el resto repartido entre Baleares, Aragón y Cataluña. La producción nacional se cifra en torno a las 90.000 t, destacando Murcia con un 65% (58.000 t) de ésta, siendo la primera productora de albaricoque, seguida de Aragón (10.000 t) y Castilla La Mancha (Albacete) (5.000 t) (MARM, 2008). El cultivo se destina tanto a la transformación industrial (cremogenados, conserva, etc.) como al consumo en fresco, siendo en este último de especial interés la calidad de los frutos. La principal variedad cultivada en Murcia y  Albacete es ?Búlida?, aportando más del 65 % de la producción. El cultivo de esta variedad tradicional está siendo en estos momentos uno de los más afectados por los virus y viroides. Las enfermedades de origen viral son uno de los mayores factores limitantes del cultivo de frutales de hueso. En el caso del albaricoquero, la enfermedad denominada "Viruela" que deja incomercializables los frutos (Foto 1) es una de las más importantes junto con la "Sharka" causada por el Plum pox virus (PPV). La "Viruela" se encuentra sobre todo presente en parcelas tradicionales de la variedad ?Búlida?. En general está aceptado que esta enfermedad es causada por el Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), aunque no existe una certeza absoluta de ello. P eña-Iglesias y Ayuso (1975) fueron los primeros investigadores que asociaron el ACLSV a la "Viruela" del albaricoquero al aislar únicamente este virus a partir de albaricoqueros que presentaban la enfermedad. Posteriormente, Llácer y col. (1985) y Peña-Iglesias (1988) pusieron en cuestión esta relación, al no encontrar el ACLSV mediante análisis ELISA en numerosos frutos que presentaban la sintomatología típica de la "Viruela". Martínez-Cutillas y Llácer (1986) observaron que albaricoquero de la variedad ?Búlida? injertados sobre ?Mariana 2624?, que estaban libres de virus, mostraron repetidamente síntomas de viruela. Esta situación también se dio también en un ?Búlida? (de más de 80 años) libre de ACLSV con abundantes síntomas de la enfermedad. Los autores pusieron en duda la asociación ACLSV-"Viruela", aunque señalaron que la presencia del virus aumentaba la sintomatología. Más recientemente Cañizares y col. (2001) y Pallás y col. (2003) demostraron la relación entre el ACLSV y la viruela, aunque la presencia de síntomas en frutos en los que no se detectó el virus, planteaban algunas dudas sobre esta relación. Entre estas dudas se indicaba el posible papel de otros virus que podrían interaccionar con el ACLSV en la expresión de la enfermedad. Por otro lado, en Italia, la enfermedad denominada "Butteratura", que presenta una sintomatología similar a la viruela, ha sido asociada con el ACLSV, si bien los resultados obtenidos no han sido concluyentes (RAGOZZINO y PUGLIANO, 1974). Alioto y col. (1995), observaron síntomas en frutos de albaricoquero similares a los descritos a la "Viruela" y a la "Butteratura", aislando el ACLSV y ocasionalmente además Prunusnecrotic ring spot virus (PNRSV) y Prune dwarf virus (PDV), por lo que asociaron al ACLSV con la enfermedad.

Acerca del estado de la viruela en las plantaciones murcianas se dispone de poca información. Domínguez y col. 1998, en un estudio realizado en esta región, encontraron más del 22 % de los albaricoqueros afectados por el ACLSV, superándose el 45 % en el caso de ?Búlida?, que es la variedad más afectada, sobre todo en combinación con el ciruelo ?Pollizo?. El objetivo de este estudio es estudiar el grado de diseminación de la "Viruela" en las plantaciones tradicionales de cultivo de la variedad ?Búlida? en las regiones más afectadas como Murcia y Castilla La Mancha, que suponen casi el 70% de la producción nacional, así como la detección de otros virus existentes en estas plantaciones afectadas.

 

Material y métodos

En este estudio se han analizado 35 parcelas de albaricoquero tradicionales cultivadas con la variedad ?Búlida? que mostraban síntomas de "Viruela" en cuatro áreas diferentes, incluyendo Pliego, Mula y Cieza en Murcia y Hellín en Albacete. En cada parcela fueron estudiados cuatro árboles con y sin síntomas de "Viruela". En total 700 frutos y 140 muestras de hojas se analizaron a partir de los 140 árboles seleccionados.

Tanto los frutos como las hojas se analizaron mediante ELISA-DAS y RT-PCR para la detección de Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV). Además, se utilizó la prueba de RT-PCR múltiple para la detección de  tros virus incluyendo PPV, Apple mosaic virus (APMV), Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV), Prune dwarf virus (PDV), Apricot latent virus (APLV), Plum bark necrosisand stem pitting-associated virus (PBNSPaV), y American pit plum latent virus (APLPV). Por último, mediante hibridación molecular (Dot Blot) y RT-PCR específica las muestras se analizaron para la detección de los viroides Hop stunt viroid (HSVd) y Peach latent mosaic viroid (PLMVd) (Foto 2).

 

Resultados y discusión

El Cuadro 1 resume los diferentes virus detectados en las áreas estudiadas. Todos los frutos que mostraron síntomas de "Viruela" fueron ACLSV positivo mediante ELISA y RT-PCR. Además, en estos frutos se detectaron otros virus como PNRSV (31% de los albaricoqueros analizados), PBNSPaV (22% de los árboles), APLV (6%), PDV (11%), y APMV (1%). No hubo árboles infectados de PPV ni de APLPV ó PLMVd. La presencia de HSVd también fue detectada en el 96% de los árboles analizados.

Sólo dos de los árboles muestreados (1,5%), no presentaron ninguno de los virus analizados. El mayor nivel de infección se localizó en las parcelas de Cehegín donde el 100% de las muestras fueron positivas para ACLSV y HSVd, el 50% para PNRSV y el 34% para PDV, dando una visión de la situación sanitaria de estas zonas de producción de albaricoque.

Los resultados obtenidos sugieren que ACLSV está estrictamente relacionada con la "Viruela" como ya fue puesto de manifiesto por Peña-Iglesias y Ayuso (1975), Cañizares y col. (2001) y Pallás y col. (2003). Por otro lado, hemos observado una variabilidad importante de los síntomas de la "Viruela" de año en año, lo que demuestra la importante influencia del ambiente en la expresión de los síntomas (Foto 3). Es necesario indicar como la falta de síntomas algunos años no garantiza la ausencia de virus, el cual se ha estado detectando mediante RT-PCR. Este hecho hace pensar en una acumulación de virus debido a factores mediaombientales en años concretos, y además en el fruto de los árboles infectados, y que hace que unos años se manifiesten más síntomas que otros. En este sentido, la falta de asociación entre "Viruela" y ACLSV observada por Llácer ycol. (1985), Peña-Iglesias (1988) y Martínez- Cutillas y Llácer (1986), puede estar debida a la dificultad de la detección del ACLSV debido a su baja concentración en algunos años. También es necesario indicar la alta concentración del ACLS observada en fruto respecto a la concentración en hoja, con valores de densidad óptica del ELISADAS tres veces superiores. Es importante así mismo destacar la ausencia de la "Sharka" (PPV) en estas plantaciones de ?Búlida?, ya que ésta se considera una variedad susceptible. Este hecho está relacionado también con los síntomas tan claros de "Sharka" en frutos, que a su vez son muy diferentes de los de "Viruela".

Respecto al sinergismo de ACLSV con otros virus, sobre todo con PNRSV y PDV, en la expresión de síntomas de "Viruela", apuntado por Alioto y col. (1995), Cañizares y col. (2001) y Pallás y col. (2003), nuestros resultados mostraron como las co-infecciones de virus detectadas fueron independientes de los síntomas de la "Viruela" (Foto 4). Estos resultados confirman la presencia de ACLSV como agente causal de la "Viruela" con una baja influencia de la presencia de otros virus o viroides. Además, la presencia de alguno de estos virus y viroides en ausencia de ACLSV no produjo síntomas de "Viruela".

Los resultados obtenidos indican la alta tasa de infección viral en las parcelas de albaricoquero tradicional ?Búlida? tanto en Murcia como en Albacete. En este sentido indicar las altas tasas de infección encontradas respecto a los últimos datos de Domínguez y col. 1998 sobre la incidencia de los virus en las plantaciones de albaricoquero de la variedad ?Búlida? en la Región de Murcia.

Estos autores usaron la hibridación molecular como técnica de detección, de ahí que en nuestros estudios con el uso de la RT-PCR que detecta incluso bajas concentraciones de virus en los árboles en campo, los niveles de infección obtenidos son más elevados y se aproximan más a la situación fitosanitaria y la amplia presencia de virus y viroides del cultivo tradicional del albaricoquero en Murcia y Albacete. También estos datos nos indican el progresivo deterioro en el estado sanitario de las plantaciones tradicionales de albaricoquero.

Finalmente, estos resultados ponen de manifiesto la primera detección de la APLV y PBNSPaV en albaricoque en España. Especialmente la detección de PBNSPaV es de interés debido a que el 22% de los árboles estudiados estaban infectados con este virus en Murcia y Castilla La Mancha. Este hecho vuelve a insistir en la grave situación fitosanitaria en la que se encuentran las plantaciones tradicionales de albaricoquero en Murcia y Albacete.

Abstract

In this study, 35 traditional apricot orchards cultivated with the old Spanish cultivar ?Búlida? and showing "Viruela" disease were analyzed in four different areas including Pliego, Mula and Cehegín in the Region of Murcia and Hellín in the Region of Castilla La Mancha. Leaf and fruit samples from four trees in each orchard with and without "viruela" symptoms were collected. In total 700 fruits and 140 leaf samples were analyzed from the 140 apricot selected trees. Both fruit and leaf samples were analyzed by ELISA, molecular hybridization and RT-PCR against Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV). In addition, we used the multiplex RTPCR test for the detection of other virus including,

Plum pox virus (PPV), Apple mosaic virus (ApMV), Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV), Prunedwarf virus (PDV), Apricot latent virus (ApLV), Plum bark necrosis and stem pitting-associatedvirus (PBNSPaV), and American plum latent pitvirus (APLPV). Finally, molecular hybridization and RT-PCR tests were assayed for the detection of the viorids Hop stunt viroid (HSVd) and Peachlatent mosaic viroid (PLMVd ). All the fruits showing "Viruela" symptoms were ACLSV positive by ELISA and RT-PCR. In addition, we detected other viruses as PNRSV (31% of apricot trees analyzed), PBNSPaV (22 % of trees), ApLV (6%), PDV (11%), and ApMV (1%). No trees infected by PPV neither APLPV were found. The presence of HSVd was also detected in the 96% of the tree assayed. Only two of the analyzed trees (1.5%) did not present any of the analyzed viruses. These results indicate the high rate of virus infection in the traditional ?Búlida? orchard and suppose the first report of ApLV and PBNSPaV in apricot from Spain. In addition, these results suggest that ACLSV is strictly related to the "viruela" disease. The synergism of ACLSV with other virus in the expression of "viruela" symptoms will be also discussed.

Agradecimientos: Este trabajo ha sido financiado por la Fundación Séneca de la Región de Murcia a través del proyecto "Importancia, transmisión e identificación de fuentes de resistencia en las principales virosis de frutales de la Región de Murcia" (08672/PI/08).

BIBLIOGRAFÍA

ALIOTO, D., STAVOLONE, L., RAGOZZINO, A. (1995) Deformation and Discoloration of apricots fruits. Acta Horticulturae 386, 118-121.

CAÑIZARES, M.C., APARICIO, F., AMARI, K., PALLÁS, V. (2001) Studies on the aetiology of apricot viruela disease. Acta Horticulturae 550, 249-255.

DOMÍNGUEZ, S, APARICIO, F, SÁNCHEZ-NAVARRO, J.A, PALLÁS, V, J., CANO, A. (1998) Studies on the incidence of ilarviruses and apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) in apricot trees in the Murcia region (Spain). Acta Horticulturae 472, 203-210

FAO (2008) http://www.fao.org/corp/statistics/es/

LLÁCER, G., CAMBRA, M., LAVINA, A., ARAMBURU, J. (1985) Suitable conditions for detecting apple Chlorotic leaf spot virus in apricot trees by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Agronomie 5, 809-812.

MARM 2008. http://www.mapa.es/es/estadistica/infoestad.html

MARTÍNEZ-CUTILLAS, A., LLÁCER, G. (1986) Observación de síntomas de viruela en variedades de albaricoquero. Actas del II Congreso de la SECH 1, 248-252.

PALLÁS, V., APARICIO, F., CAÑIZARES, M.C., AMARI, K. (2003) La viruela del albaricoquero: estudios sobre su etiología e incidencia en Murcia. PHYTOMA 145, 19.

PEÑA-IGLESIAS, A., AYUSO, P. (1975) Preliminary identification of the viruses producing apricot pseudopox (viruela) and apricot mosaic diseases. Acta Horticulturae 44, 255-258

PEÑA-IGLESIAS, A. (1988) Apricot pseudopox (viruela) diseases. Acta Horticulturae 209,163-168.

RAGOZZINO, A., PUGLIANO, G. (1974) La butteratura delle albicocche. Indagini preliminari sulla eziologia. Rivista Ortoflorofrutticoltura 58, 136-145.